ナノポア技術を用いた狂犬病ウイルスの迅速な特性評価のための全ゲノムシーケンシング

Criselda Bautista; Gurdeep Jaswant; Hollie French; Kathryn Campbell; Rowan Durrant; Robert Gifford; Grace S. N. Kia; Brian Ogoti; Katie Hampson; Kirstyn Brunker

doi:10.3791/65414

この記事について

要約
要約
概要
プロトコル
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転載および許可

要約

ここでは、ナノポア技術を用いて狂犬病ウイルス(RABV)ゲノムを特徴付けるための迅速で費用対効果の高いワークフローを紹介します。このワークフローは、地域レベルでのゲノミクス情報に基づくサーベイランスを支援することを目的としており、狂犬病対策の指針となるために、循環するRABV系統と地域系統学内でのRABV系統の位置に関する情報を提供します。

要約

ゲノムデータは、感染症の伝播と地理的な広がりを追跡するために使用できます。しかし、多くの低・中所得国(LMICs)では、イヌが媒介する狂犬病や吸血コウモリなどの野生動物が媒介する狂犬病が公衆衛生上および経済的に大きな懸念をもたらすため、ゲノムサーベイランスに必要なシーケンシング能力は依然として限られています。ここでは、ナノポア技術を使用した、サンプルから配列、解釈までの迅速で手頃な価格のワークフローを紹介します。サンプル採取と狂犬病の診断のためのプロトコルについて簡単に説明し、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマー設計と最適化、修正された低コストのシーケンシングライブラリ調製、ライブおよびオフラインベースコールによるシーケンシング、遺伝的系統指定、系統解析など、最適化された全ゲノムシーケンシングワークフローの詳細について説明します。ワークフローの実装が実証され、パイプラインの検証、プライマーの最適化、ネガティブコントロールの組み込み、地域および世界の系統発生における分類と配置のための公開データおよびゲノムツール(GLUE、MADDOG)の使用など、ローカル展開のための重要なステップが強調されています。ワークフローの所要時間は2〜3日で、コストは96サンプル実行のサンプルあたり25ドルから、12サンプル実行のサンプルあたり80ドルの範囲です。我々は、低中所得国における狂犬病ウイルスのゲノムサーベイランスの設定は実現可能であり、2030年までに犬が媒介するヒトの狂犬病による死亡をゼロにするという世界的な目標に向けた進展と、野生動物の狂犬病の蔓延のモニタリングの強化を後押しできると結論付けた。さらに、このプラットフォームは他の病原体にも適応できるため、流行やパンデミックへの備えに貢献する汎用性の高いゲノム能力の構築に役立ちます。

概要

狂犬病ウイルス(RABV)は、 ラブドウイルス科 のリッサウイルスで、哺乳類に致命的な神経疾患を引き起こします¹。狂犬病はワクチン接種によって100%予防可能ですが、蔓延国では公衆衛生上および経済的に重要な懸念事項となっています。毎年60,000人の狂犬病による死亡者数のうち、95%以上がアフリカとアジアで発生しており、犬が主な貯蔵庫^{となっています2。}対照的に、犬のワクチン接種は、西ヨーロッパ、北アメリカ、およびラテンアメリカの大部分で犬が媒介する狂犬病の撲滅につながりました。これらの地域では、狂犬病の貯水池は現在、コウモリ、アライグマ、スカンク、野生のイヌ科動物などの野生生物に限定され^{ています3。}ラテンアメリカ全土で、一般的な吸血コウモリは、夜間^の採血中にコウモリから人間と家畜の両方に定期的に波及感染するため、狂犬病の問題源となっています4。狂犬病による世界経済への影響は年間86億ドルと推定され、家畜の損失は6%を占めています⁵。

ウイルス病原体由来の塩基配列データと、感染のタイミングと発生源に関するメタデータを組み合わせることで、確固たる疫^{学的洞察を得ることができます}6。RABVでは、シーケンシングを使用して、アウトブレイクの発生源を調査し7,8、野生動物または飼い犬との宿主との関連を特定し^8,9,10,11,12、ヒトの症例の発生源を追跡し^13,14。系統解析を用いたアウトブレイク調査では、以前は狂犬病が蔓延していなかったインドネシアのバリ島で、カリマンタン島やスラウェシ島などの流行地域から1回でも狂犬病が持ち込まれたことが示されている¹⁵。一方、フィリピンでは、ロンブロン州タブラス島での発生がルソン島本島から持ち込まれたことが証明された¹⁶。ウイルスゲノムデータは、地理的な制御手段を標的とするために必要な病原体の伝播動態をよりよく理解するためにも使用されています。例えば、RABVのゲノム特性評価は、クレードの地理的クラスタリング17,18,19、系統の共循環20,21,22、ヒトを介したウイルス移動^17,23,24、およびメタ集団動態^25,26を示しています。

疾患モニタリングは、SARS-CoV-2のパンデミックに対応してシーケンシング能力が世界的に向上したことで強化されたゲノムサーベイランスの重要な機能の1つです。ゲノムサーベイランスは、懸念されるSARS-COV-2変異株のリアルタイム追跡^27,28とそれに関連する対策⁶を支えています。ナノポア技術などのアクセス可能なシーケンシング技術の進歩により、ヒト²⁹、³⁰、31、32、動物³³^、³⁴、³⁵の両方の病原体の迅速なシーケンシングのための改良された^、より手頃な価格のプロトコルがもたらされました。しかし、多くの狂犬病流行国では、SARS-CoV-2のシーケンシング能力の世界的な格差が示すように、病原体ゲノムサーベイランスの運用には依然として障壁がある³⁶。ラボのインフラ、サプライチェーン、技術的知識の限界により、ゲノムサーベイランスの確立とルーチン化が困難になっています。この論文では、リソースが限られている環境でのRABVサーベイランスのために、最適化された迅速で手頃な価格の全ゲノムシーケンシングワークフローをどのように展開できるかを示します。

プロトコル

本研究は、米国国立医学研究所医学研究調整委員会(NIMR/HQ/R.8a/vol.IX/2788)、タンザニアの地方行政・地方自治省(AB.81/288/01)、およびイファカラ保健研究所治験審査委員会(IHI/IRB/No:22-2014)。ナイロビ大学熱帯感染症研究所(P947/11/2019)およびケニアのケニア医学研究所(KEMRI-SERU;プロトコル番号3268)。フィリピン保健省熱帯医学研究所(RITM)(2019-023)。ナイジェリア産のサンプルのシーケンシングは、国家サーベイランスの一環として収集されたアーカイブされた診断資料に基づいて行われました。

注: セクション 1-4 は前提条件です。セクション 5-16 では、RABV ナノポアシーケンシングのサンプルから配列、解釈までのワークフローについて説明します(図 1)。パルス遠心分離が必要なプロトコルの後続のステップでは、10-15,000 x g で5-15秒間遠心分離します。

1. シーケンシングとデータ解析のための計算環境のセットアップ

Oxford Nanopore Technology (ONT) の Web サイト³⁷ を開き、ナノポア固有のリソースにアクセスするためのアカウントを作成します。
1. ログインして、ONTシーケンシングおよびベースコールソフトウェア³⁸をインストールします。
GitHub³⁹ を開き、アカウントを作成します。
1. artic-rabv⁴⁰ と MADDOG リポジトリ⁴¹ に移動し、インストール手順に従います。

2. マルチプレックスプライマースキームの設計または更新

注:既存のRABVスキームは、artic-rabvリポジトリ⁴⁰で入手可能である。新しい地域をターゲットにする場合は、新しいスキームを設計するか、既存のスキームを変更して多様性を追加する必要があります。

分析範囲の多様性を表すゲノム参照セットを選択します。これは通常、公開されている一連の配列(NCBI GenBankなど)または予備的な社内データです。手順2.1.1に従って、RABV配列データリソースであるRABV-GLUE⁴²を使用して、NCBI配列および関連するメタデータをフィルタリングおよびダウンロードします。
注:完全なゲノムを持つ(つまり、ギャップやマスクされた塩基がない)参照配列を選択してください。プライマー設計のリファレンスセットとして最大10個の配列を選択することをお勧めします。利用可能な配列データが不完全であるか、研究地域を代表していない場合は、補足ファイル1のアドバイス⁴³、⁴⁴^、⁴⁵を参照してください。
1. RABV-GLUEのSequence DataドロップダウンメニューからNCBI RABV Sequences by Cladeページに移動します。狂犬病ウイルス(RABV)リンクをクリックして、利用可能なすべてのデータにアクセスするか、関心のある特定のクレードを選択します。フィルターオプションを使用して、目的の基準(原産国、シーケンス長など)に適合するフィルターを追加します。シーケンスとメタデータをダウンロードします。
マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(PCR)用のプライマースキームを、Primal^{Scheme 46}の指示に従って生成します。低品質のサンプルのシーケンシングには、オーバーラップが 50 bp の 400 bp スキームが推奨されます。すべての出力をダウンロードして保存します(ファイル名やプライマー名は編集しないでください)。
注:このスキームは、入力ファスタの最初のシーケンスにインデックス付けされ、以降は「インデックスリファレンス」と呼ばれます(図2)。プライマーの性能を最適化するためのオプションについては、 補足ファイル1 を参照してください。

3. RAMPARTおよびARTICバイオインフォマティクスパイプラインのセットアップ

RAMPARTおよびARTIバイオインフォマティクスパイプラインの入出力ファイルを管理するためのディレクトリ構造を設定するには、 補足ファイル2 を参照してください。

4. バイオセーフティと実験室のセットアップ

狂犬病陽性の可能性のあるサンプルは、バイオセーフティレベル(BSL)2または3の条件で取り扱ってください。
検査室のスタッフが狂犬病の曝露前ワクチン接種を完了し、世界保健機関(WHO)^{の推奨事項に従って}免疫のモニタリングを受けていることを確認します3。
国内または国際的なガイドラインに従った専用の標準操作手順とリスク評価がラボに実施されていることを確認します。
必要なラボのセットアップ:PCR前とPCR後の領域を物理的に分離することで、汚染を最小限に抑えます。スペースが限られているラボや現場のラボ環境では、ポータブルグローブボックスやその場しのぎのラボステーションを使用して、汚染を最小限に抑えます。
このプロトコルでは、次の領域を別々に指定してください。
1. サンプル抽出:BSL2/3キャビネット/グローブボックスを設置して、生体物質を処理し、不活化とRNA抽出を行います。
2. テンプレート領域:事前に調製した反応マスターミックスにテンプレート(RNA/cDNA)を添加するためのBSL1キャビネット/グローブボックスをセットアップします。
3. マスターミックスエリア:試薬マスターミックスを調製するために、指定されたクリーンエリア(BSL1キャビネット/グローブボックス)を設置します。この領域にはテンプレートがあってはなりません。
4. PCR後の領域:アンプリコンおよびシーケンシングライブラリ調製のための作業用に別の領域を設定します。
  注意: すべての領域は、使用前と使用後に表面除染剤で洗浄し、紫外線(UV)滅菌する必要があります。

5. 現場サンプルの採取と診断

注意: サンプルは、個人用保護具を着用し、参照されている標準手順^47、48^、⁴⁹に従って^、訓練を受けた予防接種を受けた担当者が収集する必要があります。

Mauti et ^al.50 に詳述されているように、大孔 (すなわち、後頭経路) を介してサンプルを採取します。
迅速診断検査で野外で狂犬病を診断し、直接蛍光抗体検査(DFA)、直接迅速免疫組織化化学検査(DRIT)^51,52、またはリアルタイム逆転写(RT)-^PCR53などの推奨手順⁴⁷を使用して実験室で確認する。
RNA抽出には、陽性が確認された脳サンプルを使用するか、-20°Cで2〜3か月間、または-80°Cで長期間冷凍庫に保管してください。適切なDNA/RNA安定化培地を使用して、保存および輸送のためにRNAを保存します。

6. サンプル調製とRNA抽出(3時間)

注:サンプルタイプに適したスピンカラムベースのウイルス RNA 抽出キットをご使用ください。

2 mL の PCR チューブに 1.4 mm のセラミックビーズを充填した約 200 μL のチューブを充填して、2 本のセラミックビーズチューブを調製し、チューブに標識します。
RNA抽出キットに同梱されている推奨容量の溶解バッファーを標識PCRチューブに加えます。
木製のアプリケーターを使用して狂犬病感染が確認された脳サンプルから約3mmの立方体を取り出し、サンプルIDと100μLのヌクレアーゼフリー水をネガティブコントロールとラベル付けされたチューブに入れます。
注:クローズドチューブビーズベースの均質化を使用して、サンプルの曝露を制限します。不可能な場合は、他の適切な機械的破壊剤(ローターベースなど)または手動のマイクロ乳棒を使用してください。ただし、これらは、組織を破壊する硬い表面でのビーズビートよりも効果が低い場合があります(組織サンプルは特定の保存媒体で硬化する可能性があります)。
木製のアプリケータースティックを使用して脳組織を手動で破壊し、組織の完全な均質化が達成されるまで最高速度でボルテックスします。
メーカーの指示に従ってライセートを遠心分離し、ピペットを使用して上清を新しいラベル付き微量遠心チューブに移します。この上清は、以降のステップでのみ使用してください。
RNA抽出キットのスピンカラムの指示に従って、精製されたRNAを入手してください。
ここにネガティブ抽出コントロール(NEC)を含め、シーケンシング段階まで進めます。

7. cDNA調製(20分)

マスターミックスエリアでは、処理するサンプル数とコントロール数に応じて、第一鎖cDNA合成用のマスターミックスを調製します(適切な試薬を確保するために、10%の過剰容量で調製します。表1)。この段階では、テンプレートなしコントロール (NTC) を含める必要があります。
0.2 mL PCR ストリップチューブに標識し、5 μL のマスターミックスをチューブに分注します。
準備したチューブをテンプレートエリアに持っていきます。NECを含む各標識チューブに5 μLのRNAを添加します。5 μLのヌクレアーゼフリー水(NFW)をNTCに加えます。
サーマルサイクラーで、表1に示す条件に従ってインキュベートします。
注:オプションの一時停止ポイント:cDNAは、必要に応じて-20°Cで最大1か月間保存できますが、PCRに進むことをお勧めします。

8. プライマープールストックの準備 (1 時間)

注:このステップは、個々のプライマーから新しいストックを作成する場合にのみ必要であり、その後、事前に調製されたストック溶液を使用できます。

マスターミックスエリアに100 μMストックのプライマープールを調製します。
凍結乾燥したプライマーを1x tris-EDTA(TE)バッファーまたはNFWにそれぞれ100 μMの濃度で再懸濁します。徹底的にボルテックスしてスピンダウンします。
注:以下のステップでは、個々のプライマーを奇数番号(プールA)と偶数番号(プールB)の2つのプライマープールに分離し、アンプリコンの重なりに隣接するプライマー間の相互作用を回避します。これらのプライマーのプールは、標的ゲノムにまたがる重複する400 bpアンプリコンを生成します。
奇数番号のプライマーをすべてチューブラックに並べます。「primer scheme name - Pool A (100 μM)」とラベル付けされた 1.5 mL の微量遠心チューブに各プライマーから 5 μL を添加して、プライマープールストックを生成します。
偶数番号のプライマーすべてについてこのプロセスを繰り返し、「プライマースキーム名 - プールB(100μM)」とラベル付けします。
各プライマープールを分子グレードの水で1:10に希釈して、10 μMのプライマーストックを生成します。
注:10 μMのプライマー希釈液を複数回分注し、劣化や汚染が発生した場合に凍結します。

9. マルチプレックスPCR(5時間)

マスターミックスエリアの各プライマープールに1つずつ、合計2つのPCRマスターミックスを調製します。
1. プライマーあたり最終濃度は 0.015 μM です。PCR反応に必要なプライマープール容量(表2)は、以下の式を用いて計算します。
  プライマープール容量=プライマー数×反応容量×0.015/プライマー原液濃度(μM)
プールAマスターミックスとプールBマスターミックスをそれぞれ10 μLずつ、テンプレート領域の標識PCRストリップチューブに分注します。各サンプルについて、2.5 μLのcDNA(ステップ3から)を、対応する標識プライマープールAおよびB反応のそれぞれに添加します。過剰なcDNAは-20°Cで保存できます。
静かにフリックして混合し、遠心分離機をパルスします。
表2に記載の条件でサンプルをPCR装置でインキュベートします。
注:アニーリング時間が5分と長く(プライマー数が多いために必要)、アンプリコンの長さが短い(400 bp)ため、プログラムには特定の伸長ステップは含まれていません。

10. PCRクリーンアップと定量(3.5時間)

この時点から、PCR後の領域ですべての作業を実行します。
固相可逆固定化(SPRI)ビーズをメインボトルから微量遠心チューブに分注します。4°Cで保存してください。
SPRIビーズアリコートを室温(室温;~20°C)に温め、ビーズが溶液に完全に再懸濁されるまで完全にボルテックスします。
1.5 mL チューブに、各サンプルのプライマープール A とプライマープール B の PCR 産物を混ぜ合わせます。必要に応じて、水を加えて容量を25μLにします。
各サンプルに25 μLのSPRIビーズを加えます(ビーズ:サンプル比1:1)。ピペッティングで上下させるか、チューブを軽くたたいて混合します。
室温で10分間インキュベートし、時々チューブを反転またはフリックします。
ビーズと溶液が完全に分離するまで磁気ラックに置きます。ビーズペレットを乱さないように注意しながら、上澄み液を取り除き、廃棄します。
80%エタノール(RTに加温)で2回洗浄します。
1. ペレットにエタノール200μLを加えます。ビーズが適切に洗浄されていることを確認するために30秒待ちます。
2. ビーズペレットに触れないように、上澄み液を慎重に取り除いて廃棄します。
3. 手順10.8.1〜10.8.2を繰り返して、ペレットをもう一度洗浄します。
10 μLチップを使用して、微量のエタノールをすべて除去します。微量のエタノールが蒸発するまで風乾します(小さなビーズでは、これはすぐに~30秒発生します)。これが発生すると、ペレットは光沢のあるものからつや消しになります。乾燥しすぎないように注意してください(ペレットにひびが入っている場合は、乾燥しすぎています)、DNAの回収に影響を与えます。
ビーズを15 μLのNFWに再懸濁し、室温(オフマグネティックラック)で10分間インキュベートします。
磁気ラックに戻り、上清(洗浄済み製品)を新しい1.5 mLチューブに移します。
各サンプルを別々のチューブ(生成物 2 μL + NFW 18 μL)で 1:10 希釈液を調製します。
注意: この段階では、クロスコンタミネーションを避けるために十分に注意してください。一度に開くアンプリコンチューブは1本だけにしてください。最初に18 μLの水をチューブに分注します(クリーンなマスターミックスエリアで)。
protocols.io^54,55に記載されているように、高感度で特異的な蛍光光度計を使用して、希釈した各サンプルのDNA濃度を測定します。

11.ノーマライゼーション(30分)

ノーマライゼーションテンプレート(補足ファイル3)と各サンプルのDNA濃度(ng/μL)を使用して、各サンプルの総容量5 μLで各サンプルの200 fmolに必要な希釈(またはきちんとした)サンプルの容量を計算します。
新しいPCRチューブを標識し、計算されたNFWとサンプルを追加して、正規化されたDNAを取得します。
200 fmolを得るために5 μLを超える希釈サンプルが必要な場合は、未希釈(ニート)サンプルに計算された容量を使用します。
注:オプションの一時停止ポイント:この時点で、クリーンアップされたPCR産物は、必要に応じて4°Cで最大1週間保存するか、-20°Cで長期保存することができます。

12. エンドプレップとバーコード化 (1.5 h)

注:次のステップでは、ナノポア固有のバーコードおよびライゲーションシーケンシングキットの特定の試薬を使用することを前提としています(詳細については 、材料表 を参照)。このプロトコルは、異なる化学バージョン間で転送可能ですが、ユーザーはメーカーの指示に従って、互換性のあるキットを使用するように注意する必要があります。

末端補修とdAテーリング
1. 表 3 に記載されている各サンプルについて、エンドプレップ反応をセットアップします。サンプル数(プラス10%超過分)に応じてマスターミックスを調製します。試薬は粘性があるため、ピペッティングの際には注意してください。
2. 標準化されたDNAの各チューブ(5 μL)に5 μLのマスターミックスを加えます。総反応ミックスは10 μLにしてください。チップは毎回交換し、一度に1本のチューブだけを開いてください。
3. サーマルサイクラーで表 3に示す条件でインキュベートします。
バーコード
1. バーコードキットのバーコードを1.25 μL/チューブでPCRストリップチューブに分注し、各サンプルに割り当てられたバーコードを記録します。
2. 0.75 μL のエンドプレップしたサンプルを、割り当てられたバーコードアリコートに加えます。
3. サンプル数(プラス10%過剰)に応じてライゲーションマスターミックスを調製します(表4)。
4. 8 μLのライゲーションマスターミックスをエンドプレップしたサンプル+バーコードに加え、合計10 μLの反応が得られます。
5. サーマルサイクラーで、表4に示す条件でインキュベートします。
SPRIビーズのクリーンアップとDNA定量
1. ショートフラグメントバッファー(SFB)を室温で融解し、ボルテックスで混合し、パルス遠心分離機で分離し、氷上に置きます。
2. すべてのバーコード付きサンプルを1.5 mLのローバインド微量遠心チューブにプールします。クリーンアップ量が大きくなりすぎて使用できないように、各ネイティブバーコード反応から12〜24サンプル(10 μL /サンプル)、最大48サンプル(5 μL /サンプル)、または最大96サンプル(2.5 μL /サンプル)をプールします。
3. 0.4倍の量のSPRIビーズをバーコードプールに追加します。穏やかに混合し(フリックまたはピペッティング)、室温で5分間インキュベートします。
4. ビーズがペレット化し、上清が完全に透明になるまで(~2分)サンプルを磁石の上に置きます。上澄み液を取り出して廃棄します。ビーズを乱さないように注意してください。
5. 250 μL の SFB で 2 回洗浄します。
  1. チューブを磁石から取り外し、ペレットを250μLのSFBに完全に再懸濁します。30秒間インキュベートし、パルス遠心分離機にかけ、磁石に戻します。
  2. 上澄み液を取り除き、廃棄する。
6. 手順 12.3.5 を繰り返して、2 回目の SFB 洗浄を実行します。
7. パルス遠心分離機にかけ、残留SFBを除去します。
8. 200μLの80%(RT)エタノールを加えてペレットを浸します。ビーズペレットを乱さないように注意しながら、エタノールを取り出して廃棄します。30秒間、またはペレットが輝きを失うまで風乾します。
9. 22 μL の NFW を室温で 10 分間再懸濁します。
10. 磁石の上に置き、~2分間沈静化させてから、溶液を慎重に取り除き、清潔な1.5 mL微量遠心チューブに移します。
11. 前述したように、1 μLを使用してDNA濃度を得ます(ステップ10.13)。
  注:オプションの一時停止ポイント:この時点で、ライブラリは4°Cで最大1週間保存でき、長期保存の場合は-20°Cで保存できますが、アダプターのライゲーションとシーケンシングを続行することをお勧めします。

13.シーケンシング(最大48時間)

コンピューターを準備します (前提条件のセクション 1 から 4 も参照してください)。
1. 新しいデータを保存するのに十分なスペース (最小 150 GB) があること、古い実行のデータが削除する前にサーバーにバックアップ/移動されていること、および最新バージョンの MinKNOW がインストールされていることを確認します。
保管したフローセルを冷蔵庫から取り出し、RTに到達させます。
アダプターライゲーション (1 h)
1. アダプターミックスとリガーゼをパルス遠心分離し、氷上に置きます。
2. 溶出バッファー(EB)、SFB、ライゲーションバッファーを室温で融解し、ボルテックスで混合し、パルス遠心分離機で分離し、氷上に置いた。
3. アダプターライゲーションマスターミックス(表5)を調製し、低結合チューブ内で指定された順序で試薬を混合します。
  注:アダプターライゲーションマスターミックス試薬の代替品(表5)は、ラボでの在庫状況に応じて使用できます。代替案のリストについては、 補足ファイル3 および 材料表 を参照してください。 Supplementary File 3 ワークシートの計算を使用して、200 fmolに相当するDNAライブラリの体積を取得します。計算量が20 μL未満の場合は、NFWを添加して最大20 μLにします。
4. 穏やかにフリックして混合し、遠心分離機をパルスします。室温で20分間インキュベートします。
  注:インキュベーション中に、フローセルの準備を開始します(セクション13.5)。
SPRIビーズを使用してクリーンアップします(以前のクリーンアップのようにエタノールは使用しないでください)。
1. 0.4倍の量のSPRIビーズ(RT)をサンプルに添加します。室温で10分間インキュベートし、間欠的に静かにフリックして混合を促進します。
2. ビーズと溶液が完全に分離するまで(~5分)磁石の上に置きます。上澄み液を取り除き、廃棄します。ビーズペレットを乱さないように注意してください。
3. 125 μL の SFB で 2 回洗浄します。
4. ピペットで混合することにより、125 μLのSFBでペレットを完全に再懸濁します。30秒間インキュベートします。
5. パルス遠心分離機でチューブの底部に液体を集め、磁石の上に置きます。上澄み液を取り除き、廃棄する。
6. 手順13.4.4〜13.4.5を繰り返して、ペレットをもう一度洗浄します。
7. パルス遠心分離機で余分なSFBを除去します。
8. 15 μL の EB に再懸濁し、室温で 10 分間インキュベートします。
9. 磁石に~2分間戻してから、溶液を清潔な1.5 mL微量遠心チューブに慎重に移します。
10. 溶出したライブラリー 1 μL を、ステップ 10.13 で前述したように定量します
  注:最良の結果を得るには、MinIONシーケンシングに直接進んでください。ただし、最終的なライブラリは、必要に応じてEBで4°Cで最大1週間保存できます。
フローセルの品質チェックを実行します。
1. シーケンシングデバイスをラップトップに接続し、シーケンシングソフトウェアを開きます。
2. フローセルタイプを選択し、[フローセルの確認とテストの開始] をクリックします。
3. 完了すると、アクティブな(つまり、生存可能な)細孔の総数が表示されます。新しいフローセルには、>800のアクティブな細孔が必要です。そうでない場合は、製造元に交換を依頼してください。
フローセルのプライミングとローディング(20分)
1. 以下の試薬を室温で融解し、シーケンシングバッファー、フラッシュテザー、フラッシュバッファー、およびローディングビーズを氷上に置きます。
2. シーケンシングバッファーとフラッシュバッファーをボルテックスし、パルス遠心分離機にかけ、氷上に置いてください。
3. フラッシュテザーをパルス遠心分離し、ピペッティングで混合します。次に、氷の上に置きます。
4. フローセルプライミングキットからフラッシュバッファーのチューブに30 μLのフラッシュテザーを直接添加して、フローセルプライミングミックスを調製し、ピペッティングで混合します。
5. ローディングビーズはすぐに沈降するため、使用直前にピペッティングで混合してください。
6. 新鮮なチューブで、 表 5 に記載のとおり、シーケンシング用の最終ライブラリー希釈液を調製します。
  注: Supplementary File 3 ワークシートの計算を使用して、50 fmolに相当するDNAライブラリの容量を取得します。計算値が 12 μL 未満の場合は、EB を追加して最大 12 μL にします。
7. シーケンシングデバイスの蓋を裏返し、プライミングポートカバーを時計回りにスライドさせて、プライミングポートが見えるようにします(図3)
8. P1000ピペットを200 μLに設定して気泡を慎重に除去し、チップをプライミングポートに挿入し、ピペットチップに少量の液体が入るのがわかるまでホイールを回します(最大回転は230 μL)。
9. 800 μLのフローセルプライミングミックスをプライミングポートからフローセルにロードし、気泡が発生しないように注意します。
10. 5分間放置します。
11. サンプルポートカバーを静かに持ち上げ、P1000ピペットを使用してプライミングポートから 200 μLのプライミングミックスをフローセルにロードします。
12. ロード前にライブラリミックスを上下にピペットで固定し、マスターミックスのローディングビーズがロード前に再懸濁されていることを確認します。
13. 75 μL のライブラリーミックスを、サンプルポートからフローセルに滴下します。次のドリップを追加する前に、各ドリップがポートに流れ込むことを確認してください。
14. サンプルポートカバーを静かに元に戻し、栓がサンプルポートに入ることを確認します。
15. プライミングポートを閉じ、シーケンシングデバイスの蓋を取り付けます。
シーケンシングラン(最大48時間)
1. シーケンシングデバイスをラップトップに接続し、シーケンシングソフトウェアを開きます。
2. [開始] をクリックし、[シーケンスの開始] をクリックします。
3. [New Experiment] をクリックし、シーケンシングソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェース (GUI) ワークフローに従って、実行のパラメーターを設定します。
4. 実験名とサンプル ID (例: rabv_run1) を入力し、ドロップダウンメニューから [ フローセルタイプ ] を選択します。
5. キットの選択に進み、使用するライゲーションシーケンシングキットとネイティブバーコードキットを選択します。
6. 「実行オプション」に進みます。特定の時間数が経過すると実行が自動的に停止する場合を除き、既定値のままにします (実行はいつでも手動で停止できます)。
7. ベースコールに進みます。コンピューティングリソースに応じて、ベースコールのオン/オフを選択します(コンピュータの設定を参照)。バーコードの下の「オプションを編集」を選択し、「両端のバーコード」がオンになっていることを確認します。保存して出力セクションに進みます。
8. デフォルトを受け入れて最終レビューを続行し、設定を確認して、ワークシート(補足ファイル3)に詳細を記録します。「開始」をクリックします。
  注意: フローセルを再利用する場合は、 補足ファイル3のスキームに示されているように、始動電圧を(実行オプションの[詳細]セクションで)調整します。
9. 最初のアクティブチャンネルを記録し、これが品質管理(QC)チェックよりも大幅に低い場合は、シーケンシングソフトウェアを再起動します。それでも低い場合は、コンピュータを再起動します。
10. 初期チャネルをストランドと単一細孔で記録し、おおよその細孔占有率を求めます。この数値は変動しますので、概算値を与えてください。
11. 実行の進行状況を監視します。

14.ライブとオフラインのベースコール

注: これらの手順は、artic-rabv リポジトリで提供されている既存のディレクトリ構造と、プロトコルの前提条件セクション 1 と 3 に従っていることを前提としています。

ローカルファイルシステム上に、analysisという新しいディレクトリを作成し、そこにすべての分析出力を格納します。さらに整理するには、プロジェクトの名前でサブディレクトリを作成し、その中にMinKNOWに提供されたサンプルIDをrun_nameとして使用して、実行用の新しいディレクトリを作成します。これは、次のように 1 つのコマンドで行います。
mkdir -p
分析/project_name/run_name
次に、その場所に移動します。
cd
パス/分析/project_name/run_name
ライブベースコーリング
注:ナノポアベースコールをリアルタイムで実行するには、ラップトップにNVIDIA CUDA互換のグラフィックスプロセッシングユニット(GPU)が必要です。GPU ベースコール設定の指示が、グッピープロトコル⁵⁶ を使用して実行されたことを確認します。
1. 実行のセットアップ中に、ライブベースコールをオンにします。
2. RAMPARTを使用して、以下の手順に従って、シーケンシングカバレッジをリアルタイムで監視します。
3. コンピューターのターミナルで、artic-rabv conda 環境をアクティブにします。
  conda activate artic-rabv
4. run_nameディレクトリ内にランパート出力用の新しいディレクトリを作成し、そのディレクトリに移動します。
  cd /path/analysis/project_name/run_name
  mkdir rampart_output
  CD rampart_output
5. バーコードとサンプル名をペアにするバーコード.csvファイルを作成します。バーコードごとに 1 行を指定し、ライブラリに存在するバーコードのみを指定し、見出しが "barcode" と "sample" である必要があります。artic-rabvディレクトリの例に従います。
  分析/example_project/example_run/rampart_output/バーコード.csv
6. 実行のMinKNOW出力で、関連するプロトコルフォルダとfastq_passフォルダへのパスを指定して、RAMPARTを起動します。
  rampart --protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol - basecalledPath
7. ブラウザーウィンドウを開き、[URL] ボックスで localhost:3000 に移動します。十分なデータがベースコールされるのを待ってから、結果が画面に表示されます。
オフラインベースコール (実行後に実行)
1. ライブベースコールが設定されていない場合、MinKNOWからの出力は生の信号データ(fast5ファイル)になります。実行中はRAMPARTを使用できません。実行後に guppy を使用して fast5 ファイルをベースコールデータ (fastq ファイル) に変換します (前提条件の手順 1.1.1 のセットアップを参照)。ベースコールされたデータに対して RAMPART を事後的に実行します。
2. グッピーのベースコーラーを実行します。
  guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /path/to/reads/fast5_* -s /path/analysis/project_name/run_name -x auto -r
  -c はベースコールモデルを指定する設定ファイル、 -i は入力パス、 -s は保存パス、 -x は GPU デバイスによるベースコール (コンピュータ版 guppy を使用している場合は除外)、 -r は入力ファイルを再帰的に検索することを指定します。
  注: 設定ファイル (.cfg) は、_fast を _hac に置き換えることで、高精度のベースコーラーに変更できますが、これにはかなりの時間がかかります。

15. フローセルの洗浄

フローセルを洗浄して再利用し、細孔がまだ生存可能な場合は、新しいライブラリの配列決定に再利用できます。ONTフローセル洗浄プロトコル⁵⁷の洗浄手順を参照してください。

16. 分析と解釈

ARTIバイオインフォマティクスパイプラインによるコンセンサス配列生成
1. rabv_protocols フォルダー内の artic-rabv GitHub リポジトリ⁴⁰ に詳述されている手順に従って、生の fast5 または basecalled fastq ファイルからコンセンサス配列を生成します。
  注: 詳細については、「Artic パイプライン - コアパイプライン⁵⁸ 」を参照してください。
オプション: アンプリコンごとの平均読み取り深度を分析します。
1. artic-rabv リポジトリから入手できるスクリプトを、 補足ファイル 1 を参照して適応させます。簡単に言うと、SAMtools⁵⁹ と R でプロットされたヌクレオチドごとのカバレッジを使用して、詳細な統計が生成されます。
GLUEを用いた系統解析
1. RABV_GLUE⁴² から、ファイルの追加> Analysis > Genotyping and Interpretation タブを選択し、コンセンサス配列の fasta ファイルを選択します。
2. [ 送信して待機] をクリックします。解析が完了すると、[ Show Analysis ]ボタンがクリック可能になり、クレードとサブクレードの割り当て、遺伝子ごとのカバレッジ、参照配列からの変異、および最も近い近縁種が表示されます。
3. 関連するコンテキスト配列は、 クレード別のNCBI配列>配列 データ配列のセクションでも特定できます。
4. 同定されたクレードを選択するか、[ 狂犬病ウイルス(RABV)] をクリックして、利用可能なすべての配列を表示します。
5. 関連する配列(原産国など)をフィルタリングします。
6. これらの配列と対応するメタデータをダウンロードして、解析と比較を行います。
MADDOG⁴¹ を使用した系統割り当て
1. GitHubからMADDOGリポジトリをプルして、最新バージョンで作業していることを確認します。
2. ローカルの MADDOG リポジトリー (前提条件セクションで作成済み) 内に、実行名と呼ばれる割り当てフォルダーを作成します。
3. フォルダ内に、コンセンサスシーケンスを含むfastaファイルを追加します。
4. フォルダーにメタデータファイルを追加します。
  注:このファイルは、「ID」、「国」、「年」、「割り当て」という4つの列を持つcsvでなければならず、シーケンスID、サンプリングの国、サンプル収集の年を詳述し、「割り当て」列は空白にする必要があります。
5. コマンドライン・インタフェースで、conda環境をアクティブ化します:conda activate MADDOG。
6. コマンドラインインターフェイスで、MADDOGリポジトリフォルダに移動します。
7. 最初に、シーケンスに系統の割り当てを行って、潜在的な異常をチェックし、より長い系統指定ステップを実行することが適切かどうかを特定します。このためには、コマンドラインに sh assignment.sh と入力します。
8. プロンプトが表示されたら、Yを入力して、リポジトリをプルし、最新バージョンのMADDOGで作業していることを示します。
9. プロンプトが表示されたら、fasta ファイルを含む MADDOG リポジトリフォルダー内のフォルダーの名前を入力します。
10. 系列の割り当てが完了したら、フォルダー内の出力ファイルを確認します。出力が期待どおりで、同じ系列に複数のシーケンスが割り当てられている場合は、系列指定を実行します。
11. リネージュ指定を実行している場合は、作成した割り当て出力ファイルを削除します。
12. ターミナルのMADDOGリポジトリフォルダ内で、 コマンドsh designation.sh を実行します。
13. プロンプトが表示されたら、Yを入力して、リポジトリをプルし、最新バージョンのMADDOGで作業していることを示します。
14. プロンプトが表示されたら、fasta ファイルとメタデータを含む MADDOG リポジトリフォルダー内のフォルダー名を入力します。これにより、各配列に関する系統情報、新しい配列と関連する以前の配列の系統発生(16.3.6以降)、系統に関する階層情報、および潜在的に出現する系統とアンダーサンプリング領域の詳細が出力されます。
  注: プロトコル、使用法、および出力の詳細については、Campbell et ^al.60 を参照してください。
15. 初期分析が完了し、新規およびアンダーサンプリングされた系統もテストするように求められたら、必要に応じて「Y」を入力します。それ以外の場合は、「N」と入力します。
16. 新しく見つかった系列を確認するように求められたら、「Y」と入力し、結果の NEXT_STEPS.eml ファイルの指示に従います。それ以外の場合は、「N」と入力します。

結果

このプロトコルに記載されているRABVのサンプルから配列、解釈までのワークフローは、タンザニア、ケニア、ナイジェリア、フィリピンなどの蔓延国のさまざまな実験室条件で成功裏に使用されています(図4)。このプロトコルは、新鮮および凍結した脳組織、コールドチェーン下で長期間輸送された脳組織からのcDNAおよびRNA抽出物、および脳組織塗抹標本を含むFTAカードなど、さまざまなサンプルタイプおよび条件で使用されました(表6)。

RAMPARTを使用したライブベースコール(図5)は、ほぼリアルタイムでリードを生成し、サンプルあたりのカバレッジ率を示しています。これは、実行を停止し、再利用のためにフローセルを保存するタイミングを決定する際に特に役立ちます。実行時間のばらつきが観察され、2時間で終了するものもあれば、十分なカバレッジ深度(x100)に達するまでに12時間以上かかるものもあります。また、増幅が不十分な領域も表示できます。 例えば、図 6 は 1 回のシーケンシングランのスナップショットを示していますが、カバレッジプロファイルは増幅率が非常に低いアンプリコンを示しており、潜在的に問題のあるプライマーを示しています。これらの増幅不良領域をより詳細に調べることで、プライマーのミスマッチを特定することができ、個々のプライマーの再設計と改良が可能になりました。一部のプライマースキームは、他のプライマースキームよりも多くのミスマッチを示しています。これは、東アフリカ計画がはるかに広範な多様性を捉えることを目的としているため、フィリピンと比較して、目標とする多様性に沿って、東アフリカのプライマースキームで観察されます。

RABVゲノムデータ管理のための汎用リソースであるRABV-GLUE⁴²と、系統分類および命名システムであるMADDOG⁶⁰を使用して、得られたRABV配列をコンパイルおよび解釈しました。表7 は、RABV-GLUEを用いて割り当てられた各国で流通しているメジャークレードとマイナークレードを示しています。また、MADDOG割り当て後の局所系統の高解像度分類も示されています。

figure-results-1229
図1:RABVのサンプルから配列、解釈へのワークフロー。 (A)サンプル調製、(B)PCRおよびライブラリ調製、(C)シーケンシングおよびバイオインフォマティクスから分析および解釈までのステップをまとめて示しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

figure-results-1718
図2:プライマースキームの概略図。アニーリングは、A(赤)とB(緑)の2つの別々のプールに割り当てられた順方向と逆方向のプライマーのペア(半矢印)の「インデックス参照ゲノム」(濃い紫色)に沿った位置にあります。プライマーペアは、400 bpのオーバーラップアンプリコン(青)を生成し、インデックス参照ゲノムに沿って「scheme_name_X_DIRECTION」の形式で順番に番号が付けられ、「X」はプライマーによって生成されたアンプリコンを示す番号であり、「DIRECTION」は「LEFT」または「RIGHT」のいずれかであり、それぞれ順方向または逆方向を表します。「X」の奇数または偶数の値によって、プール(それぞれAまたはB)が決定されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図3:ナノポアフローセル⁴⁸。青色のラベルは、プライミング溶液を添加するプライミングポートを覆うプライミングポートカバー、サンプルを滴下するサンプルポートを覆うSpotONサンプルポートカバー、廃液ポート1および2、フローセルIDなど、フローセルのさまざまな部分を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2900
図4:2021年と2022年に最適化されたワークフローを使用してRABVシーケンシングが実施された場所を示すマップ。バブルのサイズと色は、場所ごとのシーケンス数に対応し、小さいほど暗いほど少なく、大きいほど明るいほど多くなります。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

figure-results-3345
図5:WebブラウザでのRAMPARTの可視化のスクリーンショット。バーコード名は、バイオインフォマティクスの設定に従ってサンプル名に置き換えられます。上の 3 つのパネルには、分析全体の要約プロットが表示されます:インデックス参照ゲノム上のヌクレオチド位置ごとの各バーコードのマップリードのカバレッジ深度(左上、バーコードで色付け)、すべてのバーコードからのマッピングされたリードの経時的な合計(中央上)、およびバーコードごとのマップリード(右上、バーコードで色付け)。下部のパネルには、バーコードごとのプロットの行が表示されます。左から右へ:インデックスリファレンスゲノム上のヌクレオチド位置ごとのマップリードのカバレッジ深度(左)、マップリードの長さ分布(中央)、および時間の経過とともにマップリードの10倍、100倍、1,000倍のカバレッジを獲得したインデックスリファレンスゲノム上のヌクレオチド位置の割合(右)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

figure-results-4091
図6:このプロトコルを使用してシーケンシングされたフィリピン産の狂犬病ウイルスサンプルのゲノム全体のリードカバレッジの例。ゲノム中の各ヌクレオチド位置におけるリードカバレッジが、ライブラリの生成に使用されたオーバーラップするアンプリコン(1〜41)の位置とともに示されている。カバレッジ深度のスパイクは、アンプリコンが重なっている領域に対応します。カバレッジの深さが浅いアンプリコンは、アンプリコンが重なっている領域に対応します。カバレッジの深さが浅いアンプリコンは赤で強調表示され、最適化が必要な問題領域を示します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:cDNA調製のためのマスターミックスおよびサーマルサイクラー条件。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:マルチプレックスPCRのマスターミックスおよびサーマルサイクラー条件。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:エンドプレップ反応のマスターミックスとサーマルサイクラーの条件。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4:バーコードのマスターミックスとサーマルサイクラーの条件。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表5:シーケンシング用のアダプターライゲーションマスターミックスと最終ライブラリ希釈。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表6:生成された狂犬病ウイルスの全ゲノム配列の数と、サンプルから配列、解釈へのワークフローを使用して各国で使用されたサンプルの種類。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表7:RABV-GLUEによるメジャークレードとマイナークレードの割り当て、およびワークフローを使用して生成された配列のMADDOGからの系統割り当て。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:プライマースキームの設計と最適化、およびアンプリコンリード深度分析。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:計算セットアップ このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:RABV WGSプロトコルワークシート このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

アクセス可能なRABV、ナノポアベースの全ゲノムシーケンシングワークフローは、ARTIネットワーク⁴⁶のリソースを使用して、Brunkerらによって開発された⁶¹。ここでは、サンプルから配列、解釈までの完全なステップを含む、更新されたワークフローを紹介します。このワークフローでは、全ゲノムシーケンシングのための脳組織サンプルの調製を詳細に説明し、リードを処理してコンセンサス配列を生成するためのバイオインフォマティクスパイプラインを提示し、系統割り当てを自動化し、系統発生のコンテキストを決定するための2つの狂犬病固有のツールを強調しています。更新されたワークフローでは、適切な計算ワークスペースとラボワークスペースのセットアップに関する包括的な手順も提供され、さまざまなコンテキスト (低リソース設定を含む) での実装に関する考慮事項も提供されます。私たちは、ゲノムサーベイランス能力がない、または制限されている4つのRABV風土病LMICsで、学術機関と研究機関の両方の環境でワークフローの実装に成功したことを実証しました。このワークフローは、さまざまな設定でのアプリケーションに対する回復力があり、さまざまな専門知識を持つユーザーでも理解できることが証明されています。

このRABVシーケンシングのワークフローは、一般に公開されている最も包括的なプロトコル(サンプルから配列、解釈までのステップをカバー)であり、スタートアップコストとランニングコストの両方を削減するために特別に調整されています。ナノポア技術によるライブラリ調製とシーケンシングに必要な時間とコストは、Illumina⁶¹などの他のプラットフォームと比較して大幅に削減され、継続的な技術開発により、配列の品質と精度はIllumina⁶²に匹敵するほど向上しています。

このプロトコルは、さまざまな低リソースコンテキストで回復力があるように設計されています。コアプロトコルとともに提供されるトラブルシューティングと変更のガイダンスを参照することで、ユーザーはワークフローをニーズに適合させることができます。ユーザーフレンドリーなバイオインフォマティクスツールをワークフローに追加したことで、元のプロトコルの大きな発展となり、バイオインフォマティクスの経験がほとんどないユーザーがローカルコンテキストでシーケンスデータを解釈するために適用できる、迅速で標準化された方法を提供します。これを その場で 行う能力は、特定のプログラミングと系統発生のスキルを持つ必要性によって制限されることが多く、集中的かつ長期的なスキルトレーニングへの投資が必要です。このスキルセットは、配列データを徹底的に解釈するために重要ですが、中核となる専門知識がウェットラボベースである可能性のある地域の「シーケンシングチャンピオン」がデータを解釈し、所有権を取得できるようにするためには、基本的でアクセスしやすい解釈ツールも同様に望ましいです。

このプロトコルは数カ国で長年にわたって実施されてきたため、マルチプレックスプライマースキームを最適化してカバレッジを改善し、蓄積された多様性に対処する方法についてのガイダンスを提供できるようになりました。また、ユーザーが費用対効果を向上させたり、特定の地域での調達を容易にするための努力もなされているが、これは通常、分子アプローチの持続可能性にとっての課題である⁶³。例えば、アフリカ(タンザニア、ケニア、ナイジェリア)では、アダプターライゲーションステップで、現地のサプライヤーから入手しやすく、他のライゲーション試薬よりも安価な代替品である平滑/TAリガーゼマスターミックスを選択しました。

経験上、サンプルあたりおよび実行あたりのコストを削減する方法はいくつかあります。分析ごとのサンプル数を減らすと(例:24サンプルから12サンプルに減らす)、フローセルの寿命を複数回にわたって延ばすことができ、分析ごとのサンプル数を増やすと時間と試薬が最大化されます。私たちの手では、3回のシーケンシングランに1回の割合でフローセルを洗浄して再利用することができ、さらに55個のサンプルをシーケンシングすることができました。使用後すぐにフローセルを洗浄するか、不可能な場合は、毎回の分析後に廃液を廃液チャネルから除去することで、2回目の分析に利用できる細孔の数を維持できるようでした。フローセルで利用可能な初期ポア数を考慮して、1 回の実行を最適化して、特定のフローセルで分析するサンプル数を計画することもできます。

ワークフローは可能な限り包括的になることを目指していますが、詳細なガイダンスと標識のあるリソースが追加されていますが、手順は依然として複雑であり、新しいユーザーにとっては気が遠くなる可能性があります。ユーザーは、理想的にはローカルで、または外部の協力者を通じて、対面でのトレーニングとサポートを求めることをお勧めします。例えば、フィリピンでは、ONTを用いたSARS-CoV-2ゲノムサーベイランスのための地域研究所内の能力開発プロジェクトにより、RABVシーケンシングに容易に転用できる医療診断医のコアコンピタンスが開発されました。SPRIビードのクリーンアップなどの重要なステップは、実践的なトレーニングなしでは習得が難しく、効果のないクリーンアップはフローセルを損傷し、実行を損なう可能性があります。サンプルのコンタミネーションは、アンプリコンをラボで処理する際に常に大きな懸念事項であり、除去が困難な場合があります。特に、サンプル間のクロスコンタミネーションは、分析後のバイオインフォマティクスで検出することが非常に困難です。品質管理を確実に行うには、清潔な作業面の維持、PCR前後のエリアの分離、ネガティブコントロールの組み込みなど、優れた検査技術と実践が不可欠です。ナノポアシーケンシング開発のペースが速いことは、ルーチンのRABVゲノムサーベイランスにとって有利でもあり、短所でもあります。ナノポアの精度、アクセス性、プロトコルのレパートリーの継続的な改善により、その適用範囲が広がり、改善されます。しかし、同じ開発により、標準的な操作手順とバイオインフォマティクスパイプラインを維持することが困難になっています。このプロトコールでは、古いナノポアライブラリ調製キットから最新のナノポアライブラリ調製キットへの移行を支援する文書(材料表)を提供します。

低中所得国におけるシーケンシングの一般的な障害は、コストだけでなく、消耗品(特に調達チームやサプライヤーにとって比較的新しいシーケンシング試薬)や計算リソースをタイムリーに調達する能力、そして単に安定した電力とインターネットにアクセスできることなど、アクセスのしやすさです。このワークフローの基盤としてポータブルナノポアシーケンシング技術を使用することで、これらのアクセシビリティの問題の多くに役立ち、完全なプロトコルと分析を国内で実施し、さまざまな設定でプロトコルの使用を実証しました。確かに、機器やシーケンシング消耗品をタイムリーに調達することは依然として課題であり、多くの場合、英国から試薬を運んだり、輸送したりすることを余儀なくされました。しかし、一部の地域では、SARS-CoV-2シーケンシングへの投資(フィリピンなど)により、調達プロセスが合理化され、病原体ゲノミクスの適用が正常化し始めたため、試薬の現地供給ルートに完全に依存することができました。

安定したインターネット接続の必要性は、1回限りのインストールによって最小限に抑えられます。例えば、GitHubのリポジトリ、ソフトウェアのダウンロード、ナノポアシーケンシング自体は、実行を開始するためにインターネットアクセスのみを必要とするか(全体ではなく)、会社の同意があれば完全にオフラインで実行できます。モバイルデータが利用可能な場合は、電話をラップトップのホットスポットとして使用して、実行中に切断する前にシーケンス実行を開始できます。サンプルを日常的に処理する場合、データストレージの要件は急速に増加する可能性があり、理想的にはデータはサーバーに保存されます。それ以外の場合、ソリッドステートドライブ(SSD)ハードドライブは比較的安価に調達できます。

我々は、低中所得国におけるゲノムサーベイランスには依然として障壁があることを認識しているが、ゲノミクスへのアクセスと専門知識の構築への投資の増加(例えば、アフリカ病原体ゲノミクス・イニシアティブ[アフリカPGI]⁾⁶⁴ は、この状況が改善することを示唆している。ゲノムサーベイランスはパンデミックへの備えに不可欠であり⁶、RABVなどの風土病原体のゲノムサーベイランスをルーチン化することで能力を確立することができます。SARS-CoV-2のパンデミックで浮き彫りになったシーケンシング能力の世界的な格差は、これらの構造的不平等に対処するための触媒的変化の原動力となるはずです。

アクセス可能なバイオインフォマティクスツールを含む、RABVのサンプルから配列、解釈までのワークフローは、2030年までに犬が媒介する狂犬病によるヒトの死亡をゼロにするという目標、そして最終的にはRABV変異株の排除を目標とする制御対策の指針として使用できる可能性があります。関連するメタデータと組み合わせることで、このプロトコルから生成されたゲノムデータは、アウトブレイク調査中および国または地域の循環系統の識別における迅速なRABV特性評価を容易にします60,61,65。私たちは、主に犬が媒介する狂犬病の例を使用してパイプラインを説明します。ただし、このワークフローは野生動物の狂犬病に直接適用できます。この移管性と低コストにより、狂犬病だけでなく、他の病原体^46,66,67についてもルーチンシーケンシングを簡単に利用できるようにする際の課題が最小限に抑えられ、疾患の管理と制御が改善されます。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、ウェルカム [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z]、医学研究評議会 [MR/R025649/1] およびフィリピン科学技術省 (DOST) からのニュートン資金、COVID-19 に関する英国研究イノベーショングローバルの取り組み [MR/V035444/1]、グラスゴー大学機関戦略支援基金 [204820]、医学研究評議会新人研究者賞 (KB) [MR/X002047/1] の支援を受けました。国際パートナーシップ開発基金、DOSTブリティッシュ・カウンシル・フィリピン・スチューデントシップ(CB)、国立衛生研究所[17/63/82]GemVi奨学金(GJ)、MVLS DTP(KC)[125638-06]、EPSRC DTP(RD)[EP/T517896/1]、ウェルカムIIB DTP(HF)[218518/Z/19/Z]。Daniel Streicker氏、Alice Broos氏、Elizabeth Miranda氏、DVM、Daria Manalo氏、DVM、Thumbi Mwangi氏、Kennedy Lushasi氏、Charles Kayuki氏、Jude Karlo Bolivar氏、Jeromir Bondoc氏、Esteven Balbin氏、Ronnel Tongohan氏、Agatha Ukande氏、Davis Kuchaka氏、Mumbua Mutunga氏、Lwitiko Sikana氏、Anna Czupryna氏。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brand name
Software
Sequencing software (MinKnow)	Oxford Nanopore Technologies	https://community.nanoporetech.com/downloads
Bioinformatics tool kit (Guppy)	Oxford Nanopore Technologies	https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018
Equipment
Thermal cycler (miniPCR™ mini16 thermal cycler)	Cambio	MP-QP-1016-01
Homogenizer (Precellys Evolution Touch Homogenizer)	Bertin Instruments	EQ02520-300
Cold Racks (0.2-0.5mL) (PCR Mini-cooler with transparent lid)	BRAND	781260
Pipettor
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL)	Gilson	SKU: FA10030
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL)	Gilson	SKU: FA10024
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL)	Gilson	SKU: FA10020
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL)	Gilson	SKU: FA10025
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL)	Gilson	SKU: FA10021
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL)	Gilson	SKU: FA10026
Fluorometer (Qubit 4 Fluorometer)	Thermofisher scientific/Fisher scientific	Q33238
Laptop (Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU])
Microcentrifuge (Refrigerated centrifuge)	Thermofisher scientific/Fisher scientific	75004081
Vortex mixer (Basic vortex mixer)	Thermofisher scientific/Fisher scientific	88882011
Magnetic rack (DynaMag -2 Magnet)	Thermofisher scientific/Fisher scientific	12321D
Sequencing device (MinION)	Oxford Nanopore Technologies	MinION Mk1B
RNA Extraction
RNA extraction kit (Qiagen RNEasy Mini Kit 250)	Qiagen	74106
RNA stabilizing reagents
(RNA later)	Invitrogen	AM7020
(DNA/RNA Shield)	Zymo Research	R1100-50
PCR
Nuclease-free Water (Nuclease-free Water [not DEPC-treated])	Thermofisher scientific/Fisher scientific	AM9937
Master mix for first strand cDNA synthesis (LunaScript RT SuperMix Kit)	New England Biolabs	E3010S
DNA amplification master mix (Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])	New England Biolabs	M0494L
Primer (Scheme) (Custom DNA oligos)	Invitrogen
SPRI Bead Clean-up
SPRI beads (Aline Biosciences PCR Clean DX )	Cambio	AL-AC1003-50
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen]	Merck	818760
Short Fragment buffer (SFB expansion pack)	Oxford Nanopore Technologies	EXP-SFB001
DNA Quantification
DNA quantification kit (Qubit® dsDNA HS Assay Kit)	Thermofisher scientific/Fisher scientific	Q32854
DNA quantification assay tubes (Qubit™ Assay Tubes)	Thermofisher scientific/Fisher scientific	Q32856
End Prep and barcoding (Qubit™ Assay Tubes)
End Prep master mix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)	New England Biolabs	E7546L
Barcoding kit
*Chemistry 9	Oxford Nanopore Technologies	*Chemistry 9
(Native Barcoding Expansion 1-12)		EXP-NBD104
(Native Barcoding Expansion 13-24)		EXP-NBD114
(Native Barcoding Expansion 96)		EXP-NBD196
*Chemistry 14	Oxford Nanopore Technologies	*Chemistry 14
(not compatible)		(not compatible)
(Native Barcoding Kit 24 V14)		SQK-NBD114.24
(Native Barcoding Kit 96 V14)		SQK-NBD114.96
Ligation mastermix (Blunt/TA Ligase Master Mix)	New England Biolabs	M0367S
Adapter Ligation
Adapter ligation master mix
(NEBNext Quick Ligation Module)	New England Biolabs	E6056S
(NEBNext Ultra II Ligation Module)	New England Biolabs	E7595S
(Blunt/TA Ligase Master Mix)	New England Biolabs	M0367S
Adapter mix
*Chemistry 9	Oxford Nanopore Technologies	*Chemistry 9 EXP-AMII001
(Adapter Mix II [AMII])
*Chemistry 14	Oxford Nanopore Technologies	*Chemistry 14 EXP-NBA114
(Native adapter [NA])
Sequencing
Flowcell priming kit
*Chemistry 9	Oxford Nanopore Technologies	*Chemistry 9 EXP-FLP002
(Flush Buffer [FB])
(Flush Tether [FT])
*Chemistry 14	Oxford Nanopore Technologies	*Chemistry 14 EXP-FLP004
(Flow Cell Flush [FCF])
(Flow Cell Tether [FCT])
Ligation Sequencing Kit
*Chemistry 9	Oxford Nanopore Technologies	*Chemistry 9 SQK-LSK109
Adapter Mix (Adapter Mix [AMX])
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SQB])
Elution Buffer (Elution buffer [EB])
Loading Beads (Loading Beads [LB])
Sequencing Tether (Sequencing Tether [SQT])
*Chemistry 14	Oxford Nanopore Technologies	*Chemistry 14 SQK-LSK114
Adapter Mix (Ligation Adapter [LA])
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB])
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB])
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SB])
Elution Buffer (Elution buffer [EB])
Loading Beads (Loading Beads [LIB])
Sequencing Tether (Flow Cell Tether [FCT])
Library solution (Library solution [LIS])
Flush buffer (Flow Cell Flush [FCF])
Flow Cell
*Chemistry 9	Oxford Nanopore Technologies	*Chemistry 9 FLO-MIN106D
(Flow Cell [R9.4.1])
*Chemistry 14	Oxford Nanopore Technologies	*Chemistry 14 FLO-MIN114
(Flow Cell [R10.4.1])
Flow Cell wash
Flowcell wash kit (Flow cell wash kit)	Oxford Nanopore Technologies	EXP-WSH004
Consummables
Surface decontaminant
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio])	Thermofisher scientific/Fisher scientific	7010PK
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio])	Thermofisher scientific/Fisher scientific	7002PK
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap (PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner])	Greiner	608281
PCR Tube 0.2ml (PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner])	Greiner	671201
1000µL Filter Tips (500) (Stacked 1000µL Filter Tips [500])	Thermofisher scientific/Fisher scientific	11977724
100µL Filter Tips (1000)	Thermofisher scientific/Fisher scientific	11947724
10µL Filter Tips (1000) (Stacked 100µL Filter Tips [1000])	Thermofisher scientific/Fisher scientific	11907724
Reinforced tubes tubes (2ml) with screw caps and o-rings (Fisherbrand™ Bulk tubes)	Thermofisher scientific/Fisher scientific	15545809
Microcentrifuge tube (1.5ml) (1.5 ml Eppendorf Tubes [500])	Eppendorf	1229888
DNA LoBind Tubes (1.5ml) (DNA LoBind Tubes)	Thermofisher scientific/Fisher scientific	10051232
Cryobabies labels
Gloves (S/M/L)
Paper towel

参考文献

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