内皮から間葉への移行研究のための新生児異所性ラット心臓移植モデル

要約

この研究は、重症大動脈弁狭窄症や左心低形成症候群などの先天性心疾患に見られる内皮から間葉への移行誘発性線維症の動物モデルを提示し、詳細な組織学的組織評価、調節シグナル伝達経路の同定、および治療オプションのテストを可能にします。

要約

心内膜線維弾性症(EFE)は、心内膜下組織の蓄積によって定義され、左心室(LV)の発達に大きな影響を与え、先天性重症大動脈弁狭窄症および低形成性左心症候群(HLHS)の患者を治癒的解剖学的両心室外科的修復から排除します。現在、外科的切除が唯一の治療法であるが、EFEはしばしば再発し、時には隣接する心筋へのさらに浸潤的な増殖パターンを伴う。

EFEの根底にあるメカニズムをよりよく理解し、治療戦略を探求するために、前臨床試験に適した動物モデルが開発されました。動物モデルは、EFEが未熟な心臓の病気であり、臨床観察によって裏付けられているように、流れの乱れに関連していることを考慮に入れています。したがって、新生仔ラットドナー心臓の異所性心臓移植は、このモデルの基礎です。

新生仔ラットの心臓を思春期ラットの腹部に移植し、レシピエントの腎下大動脈と下大静脈に接続します。冠状動脈の灌流はドナーの心臓の生存率を維持しますが、LV内の流れの停滞は非常に未熟な心臓のEFE増殖を誘発します。EFE形成の根底にあるメカニズムは、心内皮細胞から間葉系細胞への移行(EndMT)であり、これは弁と中隔の初期胚発生のよく知られたメカニズムですが、心不全における線維症の主な原因でもあります。EFEの形成は、移植後数日以内に肉眼的に観察できます。経腹心エコー検査は、移植片の生存率、収縮性、および吻合の開存性を監視するために使用されます。安楽死後、EFE組織が採取され、HLHS患者のヒトEFE組織と同じ組織病理学的特徴を示します。

この in vivo モデルにより、心臓におけるEFE発症のメカニズムを研究し、この病理学的組織形成を予防するための治療オプションをテストすることができ、EndMT誘発性線維症のより一般的な検査の機会を提供します。

概要

心内膜線維弾性症(EFE)は、心内膜下組織におけるコラーゲンおよび弾性線維の蓄積によって定義され、真珠状または不透明な肥厚した心内膜として現れる。EFEは、胎児期^と乳児期初期に最も活発な成長を遂げます1。剖検研究では、左心低形成症候群(HLHS)の症例の70%がEFE²の存在と関連していました。

線維芽細胞のマーカーを発現する細胞はEFEの主要な細胞集団であるが、これらの細胞は同時に心内膜内皮マーカーも発現しており、これはこれらのEFE細胞の起源を示すものである。私たちのグループは、EFE形成の根底にあるメカニズムには、内皮から間葉への移行(EndMT⁾³を介した心内皮内皮細胞から線維芽細胞への表現型の変化が関与していることを以前に確立しました。EndMTは、分化クラスター(CD)31や血管内皮(VE)-カドヘリン(CD144)などの内皮マーカーと線維芽細胞マーカー(α-平滑筋アクチン、α-SMAなど)の免疫組織化学的二重染色を使用して検出できます。さらに、このプロセスにおけるTGF-β経路の調節的役割は、転写因子であるSLUG、SNAIL、および^TWIST3の活性化によって確立されました。

EndMTは、胎児期の心臓の発達中に発生....

プロトコル

すべての動物実験は、全米研究評議会(National Research Council)に従って実施されました。2011. 実験動物のケアと使用に関するガイド: 第 8 版。動物のプロトコルは、ボストン小児病院の施設動物ケアおよび使用委員会によってレビューされ、承認されました。

手術前に、すべての手術器具を蒸気オートクレーブ滅菌し、最終濃度が22 mmol / L KClの修飾されたKrebs-Henseleitバッファーを心臓麻痺溶液として調製します(表1)。溶液をフィルター滅菌し、4°Cで一晩保存します。異所性新生仔ラットの心臓移植手術には手術用顕微鏡(12.5倍)が必要です。

1.準備と麻酔

1. レシピエントとして、体重約150 g(5〜6週齢)の雄/雌のルイスラットを使用します。
2. まず、ネズミの腹部をカミソリでたっぷりと剃ります。
3. ラットをイソフルランチャンバーに入れ、動物が適切に鎮静され、自発呼吸するまで、2%イソフルランで2 L / minの酸素流量をオンにします。45 mg / kgのケタミンと5 mg / kgのキシラジンを腹腔内(IP)、および300 U / kgのヘパリンに注射します。.つま先のつまみテストで適切な麻酔を確認します。
   注意: 胸部の触診を通じて自発呼吸と心拍....

ディスカッション

レシピエントの腹部に新生仔ドナーラットの心臓を異所性移植するこの動物モデルは、詳細な組織学的組織評価を通じてEndMT由来の線維症を研究し、調節シグナル伝達経路を特定し、治療オプションをテストする可能性を生み出します。EndMTは心臓の線維化性疾患の根底にあるメカニズムであるため、このモデルは小児心臓外科の分野やそれ以降の分野で大きな価値があります。このモデルで.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software