免疫成分を用いた基本的な3次元(3D)腸管モデルシステム

要約

ここでは、基本的な3次元(3D)腸細胞株モデルシステムの構築と、固定された腸当等物の光学顕微鏡的評価のためのパラフィン包埋プロトコルについて説明します。選択したタンパク質を染色することで、1回の実験で複数の視覚的パラメータを解析し、前臨床薬物スクリーニング研究に活用することができます。

要約

炎症性腸疾患の病態生理学の研究、潜在的に有益な物質の薬理学的スクリーニング、および潜在的に有害な食品成分の毒性研究のために、 in vivo および in vitro 腸モデルの使用が増加しています。関連して、動物モデルに代わる細胞ベースの in vitro モデルの開発が現在求められています。ここでは、細胞株を使用した基本的な「健康な組織」の三次元(3D)腸と同等モデルのプロトコルが、実験のシンプルさ(標準化され、容易に再現可能なシステム)と生理学的複雑さ(U937単球とL929線維芽細胞の支持免疫成分を持つCaco-2腸細胞)の両方を提供するという二重の利点を備えています。このプロトコルには、固定腸当量物の光学顕微鏡評価のためのパラフィン包埋も含まれており、それによって1回の実験から複数の視覚パラメータを分析するという利点を提供します。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色した切片は、対照処理でCaco-2柱状細胞がタイトで規則的な単層を形成していることを示すもので、実験システムとしてのモデルの有効性を検証するために使用されます。グルテンを炎症誘発性食品成分として使用し、切片から分析したパラメータには、単層の厚さの減少、基礎となるマトリックス(H&E)からの破壊と剥離、オクルージン染色(統計的に定量化可能)から示されるようなタイトジャンクションタンパク質発現の減少、分化クラスター14(CD14)染色とCD11b関連のマクロファージへの分化から証明される遊走U937細胞の免疫活性化が含まれます。リポ多糖類を用いて腸の炎症をシミュレートすることによって示されるように、測定可能な追加のパラメータは、粘液染色の増加および固定前に培地から抽出することができるサイトカイン発現(ミッドカインなど)である。基本的な3次元(3D)腸粘膜モデルと固定切片は、複数の視覚的に定量化可能なパラメータを分析する可能性を備えた炎症状態とバリアの完全性の研究に推奨できます。

概要

腸管上皮関門は、異なる種類の上皮細胞を含む1細胞厚の内層であり^、身体の外部環境と内部環境との間の最初の物理的防御障壁または界面を構成する^1,2。円柱型腸細胞は、上皮細胞の中で最も豊富なタイプを構成します。これらは、タイトジャンクション(TJ)を含むいくつかのバリアコンポーネント間の相互作用を通じて上皮バリアの完全性を維持する役割を担っており、バリアの引き締めに重要な役割を果たしています^1,3。TJ構造は、閉塞帯帯(ZO)やシングリンなどの細胞内プラークタンパク質からなり、オクルージン、クローディン、接合接着分子(JAM)などの膜貫通タンパク質と協働して、^{隣接する細胞を}緊密につなぐジッパー状の構造を形成します^3,4。膜貫通型タンパク質は、低分子化合物の受動的な傍細胞拡散を調節し、有毒な高分子を排除します。

潜在的に有毒な食品化合物や食品汚染物質は、炎症性サイトカイン産生を刺激し、上皮透過性を破壊し、免疫細胞を活性化し、慢性的な腸組織の炎症を引き起こします

プロトコル

1. 基本的な3D再建腸粘膜モデルの作成

注意: 手順全体は、滅菌層流フードで実行する必要があります。細胞インキュベーターの使用を含む手順のすべてのステップは、培養物が5%_CO2 を含む加湿雰囲気中で37°Cでインキュベートされることを意味します(プロトコルに別段の記載がない限り_)。

1. 腸管モデル系で使用する細胞株の事前調製
   1. 2 mM L-グルタミン、10%ウシ胎児血清(FBS)、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-Strep)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM⁾⁵ mLの濃度でL929マウス線維芽細胞をF25フラスコに播種し、腸モデルの構築の4日前にインキュベーターで培養します。48時間後、ピペットを使用して培地を取り除きます。次に、新鮮な培地(5 mL)を加え、細胞をさらに48時間インキュベートします。
      注:セルは、使用する前に80%コンフルエントである必要があります。
   2. Caco-2細胞(濃度2 x 10⁶)を10 mLのDMEM培地(10%FBSおよび1%Pen-Strepを含む)のF75細胞フラスコに播種し、腸粘膜モデルを構築する4日前にインキュベーターで培養します。48時間後、ステップ1.1.1の説明に従って培地を交換し、さらに48時間インキュベートしてコンフルエントが80%になります。
      注:....

ディスカッション

ここで紹介する基本的な再建腸粘膜モデルシステム(図6)は、生理学的複雑さ(線維芽細胞と単球を含むECMに富む固有層支持体を持つCaco-2単層を含む、より生理学的に関連性のある3D細胞培養)と実験の単純さ(市販のヒト細胞株を使用して標準化され、再現性のあるシステムを作製する)を兼ね備えています¹³.そのため、このモデルシステムは、潜在的な医?.......