骨髄由来マクロファージ由来の微小細胞外小胞ペプチドの同定

要約

このプロトコルは、示差超遠心によってマクロファージから小さな細胞外小胞を単離し、質量分析による同定のためにペプチドームを抽出する手順を説明しています。

要約

小さな細胞外小胞(sEV)は、通常、多胞小体(MVB)のエキソサイトーシスによって分泌されます。直径<200nmのこれらのナノベシクルは、さまざまな体液中に存在する。これらのsEVは、タンパク質、DNA、RNA、代謝物などの貨物を介して、遺伝子の転写と翻訳、細胞の増殖と生存、免疫と炎症などのさまざまな生物学的プロセスを調節します。現在、sEVの絶縁のためにさまざまな技術が開発されています。その中で、超遠心分離ベースの方法はゴールドスタンダードと見なされており、sEVの分離に広く使用されています。ペプチドは、長さが50アミノ酸未満の天然の生体高分子です。これらのペプチドは、ホルモン、神経伝達物質、細胞成長因子などの生物学的活性を有する様々な生物学的プロセスに関与している。ペプチドドームは、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)によって特定の生物学的サンプル中の内因性ペプチドを体系的に分析することを目的としています。ここでは、示差超遠心法によってsEVを単離するプロトコルを導入し、LC-MS/MSによる同定のためにペプチドドームを抽出しました。この方法により、骨髄由来マクロファージから数百のsEV由来ペプチドが同定されました。

概要

直径200nm未満の小さな細胞外小胞(sEV)は、ほぼすべての種類の体液に存在し、尿、汗、涙、脳脊髄液、羊水など、あらゆる種類の細胞から分泌されます¹。当初、sEVは細胞廃棄物を処分するための容器と見なされていたため、その後の10年間で最小限の研究につながり^{ました2。}最近、sEVに特定のタンパク質、脂質、核酸、およびその他の代謝物が含まれていることを示す証拠が増えています。これらの分子は標的細胞³に輸送され、細胞間コミュニケーションに寄与し、それを介して組織修復、血管新生、免疫4および炎症^5,6、腫瘍の発生および転移^7,8,9などの様々な生物学的プロセスに関与する。

sEVの研究を容易にするには、複雑なサンプルからsEVを分離することが不可欠です。sEVの密度、粒子サイズ、表面マーカータンパク質など、sEVの物理的および化学的特性に基づいて、さまざまなsEV分離方法が開発されています。こ....

プロトコル

1. 小細胞外小胞の単離

注意: 1.1°Cでステップ1.1-1.11のすべての遠心分離を実行します。

1. sEVフリーウシ胎児血清(FBS)の調製:FBSを超遠心分離機(材料表を参照)を介して4°Cで110,000 × gで一晩遠心分離し、内因性sEVを除去します。上清を回収し、0.2 μm限外ろ過膜でろ過滅菌し、-20°Cで保存します。
2. 150 mm培養皿に約3 x 10⁷ 不死化骨髄由来マクロファージ(iBMDM)をプレートし、20 mLのDMEM培養液を加え ます(材料表を参照)。
3. sEVを収集する前に、メディアを廃棄してください。細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水; 材料表)10%sEVフリーのFBSを含む培地と交換します。
4. 実験の必要性に応じて、細胞上清を収集し、50 mL遠沈管に移します。
5. 細胞上清を300 × g で10分間遠心分離して細胞を除去し、ペレットを廃棄し、上清を新しい50 mL遠沈管に移します。
6. 上清を2000 × g で10分間遠心分離して死細胞を除去し、ペレットを廃棄し、上清を新しい高速遠心チューブに移します(

ディスカッション

sEVの機能を調べる際には、潜在的な汚染を避けるために、複雑な生物学的サンプルから高純度のsEVを得ることが不可欠です。sEVの分離にはさまざまな方法が開発されており¹³、これらの方法の中で、示差超遠心ベースの方法は比較的高い純度のsEVを示しています。本研究では、200 mLの細胞上清を6時間回収し、示差超遠心により約200〜300 μgのsEVが得られた。ただし、超遠心分.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Centrifugal filter tube	Millipore	UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene	Beckman Coulter	357003	High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
DMEM culture medium	Cell World	N?A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
High-speed centrifuge	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)	National Institute of Biological Sciences, China		Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide	Sigma	l1149	5 g
Microfuge tube polypropylene	Beckman Coulter	357448	1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge
nano-high-performance LC system	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Phosphate-buffered saline	Solarbio	P1020
Polyallomer centrifuge tubes	Beckman Coulter	326823	Ultracentrifuge
Protease inhibitor	Bimake	B14002
SpeedVac vacuum concentrator	Eppendorf	Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor	Scientz	SCIENTZ-IID
Western Blot imager	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin	Sigma	A3853