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要約

本研究では、ラベルフリーの生細胞バイオイメージングを示し、2つの細菌株を検出するために、良好な生体適合性を有する低コストの表面増強ラマン散乱(SERS)ベースの指紋ナノプローブを開発し、非破壊法で生細胞のSERSスペクトルを取得する方法を詳細に示した。

要約

表面増強ラマン散乱(SERS)技術は、生体試料の分子フィンガープリント情報を提供できることや、シングルセル解析の可能性から、生物医学分野でますます注目を集めています。この研究は、Au@carbonドットナノプローブ(Au@CDs)に基づくラベルフリーSERSバイオアナリシスのための簡単な戦略を確立することを目的としています。ここでは、ポリフェノール由来のCDを還元剤として利用してコアシェルAu@CDナノ構造を迅速に合成し、協同ラマン増強機構により、メチレンブルー(MB)の濃度が10〜9 Mと低い場合でも強力なSERS性能を実現します。バイオ分析のために、Au@CDsは、バイオサンプルの細胞成分(例えば、癌細胞および細菌)を識別するためのユニークなSERSナノセンサーとして機能することができる。異なる種の分子フィンガープリントは、主成分分析との組み合わせ後にさらに区別することができます。さらに、Au@CDsは、細胞内組成プロファイルを分析するためのラベルフリーSERSイメージングも可能にします。この戦略は、実行可能なラベルフリーのSERSバイオアナリシスを提供し、ナノ診断の新たな展望を開きます。

概要

単一細胞解析は、細胞の不均一性を明らかにし、細胞の包括的な状態を評価する研究に不可欠です。微小環境に対する細胞の即時応答も、単一細胞解析を保証します1。ただし、現在の手法にはいくつかの制限があります。蛍光検出はシングルセル解析にも適用できますが、感度が低いという制約があります。他の課題は、細胞の複雑な蛍光バックグラウンドと長期照射下での蛍光光退色から生じます2。表面増強ラマン散乱(SERS)は、(1)固有の分子フィンガープリント情報と瞬間的な状況を反映する、(2)超高表面感度、(3)便利なマルチプレックス検出、(4)高い光安定性、(5)比較分析のために検出を定量できる、(6)NIR波長励起による細胞自家蛍光の回避、(7)検出は細胞水溶液で実行できる、などの利点があるため、単一細胞分析の観点から適格である可能性があります環境、および(8)検出は、細胞3、4、5内の特定の領域に向けることができる。

SERSを基本的な現象として理解するために広く認識されている2つのメカニズムがあります:支配的な理由としての電磁増強(EM)と化学的増強(CM)。EMとは、励起場の所定の周波数において、入射光の周波数が金属内で振動する自由電子の周波数と一致し、表面プラズモン共鳴(SPR)を引き起こすときに、電磁波によって駆動される集合電子の振動を指します。局在SPR(LSPR)が金属ナノ粒子(NP)に衝突する入射レーザーを介して発生すると、入射光の共鳴吸収または散乱につながります。その結果、金属NPの表面電磁界強度を2〜5桁向上させることができます4。ただし、SERSの大幅な強化の鍵は、単一の金属NPではなく、ホットスポットを作成する2つのNP間のギャップです。CMは、(1)標的分子と金属NPとの相互作用、(2)標的分子が金属NP4,5との間で電子を移動できることの2つの側面から生成されます。より網羅的な詳細は、これらのレビュー記事4,5に記載されています。生細胞におけるSERSバイオセンシングおよびイメージングのためのいくつかの有望な方法が以前の文献に提示されており、例えば、アポトーシス細胞6、細胞小器官7におけるタンパク質7、細胞内miRNAX8、細胞脂質膜9、サイトカイン10、および生細胞における代謝産物11の検出、ならびに共焦点SERSイメージング2による細胞の同定およびモニタリング、 11、12、13。興味深いことに、ラベルフリーSERSは、内部分子スペクトル5を記述できるSERSのユニークな利点を提供します。

ラベルフリーSERSの大きな問題は、合理的で信頼性の高い基質です。典型的なSERS基板は、多くの光を散乱させる優れた能力があるため、貴金属NPです14。今日では、その顕著な物理的および化学的特性および生体適合性のために、ナノコンポジットにますます注目が払われている。さらに重要なことに、ナノコンポジットは、ナノハイブリッド上のホットスポットによって誘発される強烈なEMおよび他の非金属材料に由来する追加の化学的増強のために、より良好なSERS活性を示すことができる15。例えば、Feiらは、マウス4T1乳がん細胞(4T1細胞)のラベルフリー近赤外(NIR)SERSイメージングのために、Au NP@MoS 2 QDナノコンポジットを合成するための還元剤としてMoS2量子ドット(QD)を使用しました16。また、Liらは、食品媒介病原菌のラベルフリーSERS測定のために、Au NPsと2Dハフニウムジテルル化物ナノシートからなる2D SERS基板を作製した17。近年、良好な電子供与体であるカーボンドット(CD)が、他の還元体や照射を伴わずに還元体として使用され、Au@carbonドットナノプローブ(Au@CDs)18を合成し、AuコアとCDシェル間の電荷移動(CT)効果に基づいてSERS活性を高める効率的な材料であることが報告されています19,20。それ以上に、CDはキャッピング剤およびAu NPが凝集するのを防ぐための安定剤として認識されています21。さらに、それは多数の結合部位および活性部位を提供することができるので、分析物との反応のためのより多くの可能性を開く20。上記を利用して、Jinらは、不均一な触媒反応をリアルタイムで監視するための独自のSERS特性と優れた触媒活性を備えたAg@CD NPを製造するための高速で制御可能な方法を開発しました18。

ここでは、コアシェルAu@CD SERS基質を作製して細胞成分を同定し、ラベルフリーのSERS生細胞バイオイメージング、ならびに 大腸菌 (大腸菌)と黄色 ブドウ球菌 (黄色ブドウ球菌)を検出および鑑別するための簡単で低コストの方法が実証され、疾患の早期診断と細胞プロセスのより良い理解に有望です。

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プロトコル

1. Au@CDsの製作

メモ: 図 1 は、Au@CDsの製造手順を示しています。

  1. 典型的な水熱処理手順18を介してクエン酸(CA)および没食子酸(GA)を使用してCD溶液を調製する。調製したCD溶液3.0 mL-1 100 μLを10 mM塩化金酸(HAuCl4)200 μL(材料表を参照)に室温で紫色の懸濁液が生成されるまで10秒間加えます。
  2. 紫色の懸濁液を4,000 × g で室温で10分間遠心分離し、Au@CDコロイドの除去が困難な場合はピペットを使用して上清を静かに除去します。
  3. Au@CDsを200 μLの脱イオン水(抵抗率18.2 MΩcm)で再懸濁し、余分なCDを洗浄します。
  4. ステップ1.2を繰り返してコアシェルNPを取得し、100 μLの脱イオン水に再分散し、4°Cで保存します。 NPは1ヶ月間保管することができます。

2. Au@CDsの特性評価

  1. 透過型電子顕微鏡(TEM)
    1. CDとAu@CDサンプルを-80°Cで一晩放置して凍結溶液から凍結乾燥し、凍結乾燥後に粉砕して粉末にします。
    2. 得られた粉末サンプルを超音波処理によって脱イオン水に適切に分散させ、100%の電力で、5分間。
    3. レーシーカーボンフィルムで覆われたCuコーティングされたTEMグリッドにサンプル懸濁液を数滴下し、200 kVの加速電圧で透過型電子顕微鏡を使用して乾燥後の画像をキャプチャします( 材料表を参照)。
  2. フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)
    1. ステップ2.1.1を繰り返してパワーサンプルを取得し、事前に乾燥したいくつかのKBr粒子を乳鉢で粉末に粉砕し、サンプルをピンチ追加し、KBr粉末と同時に混合してIR特性評価を行います16。
  3. 紫外可視近赤外(紫外対近赤外)吸光度分光法
    1. 吸光度が1未満になるように適切な濃度のCDおよびAu@CDsの懸濁液を調製し、UV-vs-NIRの特性評価を実行します16。
  4. ラマンスペクトル
    1. 10 mWのレーザー出力と20倍のオブジェクション倍率で785 nmの半導体レーザーをオンにします。露光時間を 5 秒、累積数を 3 に設定します。
    2. 等量の調製Au@CDsサンプルを5 μLのメチレンブルー(MB)溶液に加え、十分に混合します。
    3. 真鍮基板上に懸濁液を一滴垂らして、SERSスペクトルを収集します。

3. 細胞培養

  1. ヒト上皮肺癌細胞(A549細胞、実験室で継代)を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養し、5%CO2を含む37°Cの加湿インキュベーター内でインキュベートします。
  2. 細胞を96ウェルプレート(1 × 105 細胞/ウェル)に播種し、20〜100 μMの範囲のさまざまな濃度のAu@CDsで処理します。 CCK-8アッセイキットを使用して、細胞生存率を測定します( 材料表を参照)。各処理では、3つの独立した複製が使用されます。
  3. SERS実験を実行するには、次の手順に従います。
    1. 滅菌サファイアチップ( 材料表を参照)を12ウェルプレートに入れ、1 mLの培地を入れたシングルウェルに細胞を播種します。プレートを加湿インキュベーター内で37°C、5%CO2で一晩インキュベートし、70%〜80%のコンフルエントに到達させます。
    2. Au@CDsを単一のウェルに加え、4〜6時間インキュベートします。
      注:インキュベーションの前に、基質、特に溶液相NPの安定性をテストしてください。これらの材料は、保管および使用中の溶解、凝集、および沈降プロセスによる劣化の影響を受けやすく、EM損失が減少し、SERS活性が低下する可能性があります。さらに重要なことに、細胞内取り込みについては、NPs22のサイズに大きく影響される可能性がある。
    3. インキュベーション中、基質はエンドサイトーシスの取り込みによって細胞に入ります。インキュベーション後、細胞内にいくつかの黒い粒子が見られるまで、光学顕微鏡で細胞を観察します。
      注:SERS強度が弱い場合は、Au@CD濃度を高めるか、インキュベーション時間を延長してください。
    4. 培地を取り出し、サファイアチップをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で穏やかにすすぎ、SERS検出16のためにPBSに浸します。

4. 細胞SERS実験

  1. コンピューターを開き、ラマン分光計の電源を入れ、ソフトウェアを起動してから、785 nmレーザーの電源を入れます( 材料表を参照)。
  2. [新しい 測定 ]をクリックして、新しいスペクトル取得を開始します。サンプル測定の前に、シリコンウェーハで17を校正します。
  3. 鮮明な細胞画像が観察されるように20倍の対物レンズを取り、次に対物レンズを50倍に変更します。レーザー出力を低から高に設定し、適切な露光時間と蓄積を設定します。
    注意: SERS測定の前に、適切なレーザー出力をチェックして、不可逆的な細胞の損傷を防ぎ、取得パラメーターが一貫していることを確認してください。SERS強度は、レーザー出力、スポットサイズ、蓄積、および露光時間に関連しています。
  4. 測定するセルのポイントを選択し、[ 実行]をクリックします。各細胞は20個のスポットで測定され、10個の細胞が測定されて平均が取られます。
    注:細胞内成分は複雑であり、広いスペクトル格差につながります。したがって、同様の細胞領域でスペクトルを取得し、できるだけ多くのスペクトルを取得します。
  5. スペクトルを保存します。
  6. [新しいストリームライン画像取得]をクリックし、[ビデオレビュー]をクリックして、撮影する範囲を選択し、[OK]をクリックします。パラメータを設定します:785 nmのエッジストリームライン、1,200 cm-1の中心、露光時間5秒、蓄積数3、レーザー出力50%。
  7. [新しい of Living イメージング] をクリックし、[信号からベースライン] を選択し、最初の制限 625 から 2 番目の制限 1,700 までの範囲を設定して、[エリア設定] をクリックします。次に、適切な手順を設定し、[適用]と[OK]をクリックします。最後に、[実行]をクリックしてSERSイメージングの実行を開始します。

5. 細菌培養とSERS測定

  1. 大腸菌と黄色ブドウ球菌の一晩培養(1:100)を5 mLの新しいルリアベルターニ(LB)培地で希釈します(材料表を参照)。A600を0.4〜0.6に37°Cで増殖させた後、培養物を5,000 × gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化した。
  2. ペレットを1 mLのPBSに再懸濁した後、5分間5,000 × g の遠心分離(室温)を2回行います。
  3. 細菌培養物をAu@CDsと混合し、SERSプラットフォームの真下で混合物を観察します。

6.データ分析

  1. スペクトルを平滑化し、ベースラインを修正します。
  2. 処理されたデータで主成分分析(PCA)16を実行します。

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結果

Au@CDsの製作を図1に示す。CDは、典型的な熱水プロセスを介してCAおよびGAから調製された18。Au@CDsは、室温で水性媒体中でCDによってHAuCl4を還元することによって迅速に合成された。CDおよびAu@CDsのサイズおよび形態は、TEMおよび高分解能(HR)TEM23によって観察することができる。調製されたCDは、約2〜6 nmの小?...

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ディスカッション

要約すると、2.1nmの超薄型CDシェルを備えたAu@CDsが正常に製造されました。ナノコンポジットは、純粋なAu NPよりも優れたSERS感度を示します。また、Au@CDs再現性と長期安定性に優れた性能を持っています。さらなる研究には、A549細胞31のSERSイメージングを実行し、2つの細菌株32を検出するための基質としてAu@CDsを取ることが含まれる。Au@CDsは、主にAu NPとCD?...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学財団(32071399および62175071)、広州科学技術プログラム(2019050001)、広東基礎応用基礎研究財団(2021A1515011988)、および中国教育省(福建師範大学)の医学のための光電子科学技術の主要研究所のオープン財団(JYG2009)の支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBS buffer (Cell culture)Langeco TechnologyBL316A
6 well cell culture plateLABSELECT11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)GLPBIOGK10001
Citric acidShanghai Aladdin Biochemical TechnologyC108869
CO2 incubatorThermo Fisher Technologies3111
Constant temperature magnetic agitatorSartorius Scientific InstrumentsSQP
Cryogenic high speed centrifugeShanghai BoxunSW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture mediumProcellPM150210
Electronic balanceSartorius Scientific InstrumentsSQP
Enzyme markerThermo Fisher Technologies3111
Fetal bovine serumZhejiang Tianhang Biological Technology11011-8611
Figure 1Figdraw.
Fourier infrared spectrometerThermo, AmericaNicolet 380
Freeze dryerTecanInfinite F50
Gallic acidShanghai Aladdin Biochemical TechnologyG104228
Handheld Raman spectrometerOCEANHOOD, Shanghai, ChinaUspectral-PLUS
HAuCl4Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscopeThermo Fisher TechnologiesFEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclaveShanghai BoxunYXQ-LS-50S figure-materials-1875
Inverted microscopeNanjing Jiangnan Yongxin OpticalXD-202
LB Broth BRHuankai picoorganism028320
Medical ultra-low temperature refrigeratorThermo Fisher TechnologiesULTS1368
Methylene blueSigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive SolutionbeyotimeC0207
Penicillin streptomycin double resistanceShanghai BoxunYXQ-LS-50S figure-materials-2549
Pure water meterMillipore, USAMilli-Q System
Raman spectrometerRenishaw
Sapphire chipbeyotime
Thermostatic water bathChangzhou Noki
Ultra-clean tableShanghai BoxunSW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometerMADAPA, ChinaUV-6100S
Wire 3.4Renishaw

参考文献

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