ゼブラフィッシュ成魚の行動性における前脳活動の2光子カルシウムイメージング

要約

ここでは、成体のゼブラフィッシュの背側前脳で2光子カルシウムイメージングを行うためのプロトコルを紹介します。

要約

成魚のゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、認知機能を研究するための豊富な行動レパートリーを示します。また、光学イメージング法によって脳領域全体の活動を測定するために使用できるミニチュア脳も備えています。しかし、ゼブラフィッシュの成体における脳活動の記録に関する報告は少ない。本研究では、成体のゼブラフィッシュの背側前脳に2光子カルシウムイメージングを行う手順について記載する。ゼブラフィッシュの成体が頭部を動かすのを抑制する手順に着目し、脳活動のレーザースキャニングイメージングを可能にする安定性を提供します。頭を拘束された動物は、補助具なしで体の部分を自由に動かし、呼吸することができます。この手術は、頭部拘束手術の時間を短縮し、脳の動きを最小限に抑え、記録されるニューロンの数を最大化することを目的としています。カルシウムイメージング中に没入型の視覚環境を提示するためのセットアップもここで説明されており、視覚的に誘発される行動の根底にある神経相関を研究するために使用できます。

概要

遺伝子コードされたインジケーターまたは合成色素を用いたカルシウム蛍光イメージングは、ヒト以外の霊長類、げっ歯類、鳥類、昆虫などの行動動物の神経活動を測定する強力な方法です¹。脳表面から約800μm下までの数百の細胞の活動は、多光^{子イメージングを用いて}同時に測定することができます^2,3。特定の細胞タイプの活性は、遺伝的に定義された神経集団でカルシウム指標を発現することによっても測定できます。小型脊椎動物モデルへのイメージング法の適用は、脳領域を横断する神経細胞計算の分野に新たな可能性を開きます。

ゼブラフィッシュは、神経科学研究で広く使用されているモデルシステムです。受精後約6日目のゼブラフィッシュ仔魚は、脳が小さく^、体が透明であるため、カルシウムイメージングに使用されています4。ゼブラフィッシュの稚魚(生後3〜4週間)は、感覚運動経路の根底にある神経メカニズムの研究にも使用されます^5,6。しかし、連想学習や社会的行動を含む複雑な行動の最大パフォーマンスレベルは、^7,8

プロトコル

すべての動物処置は、中央研究院の動物実験委員会のガイドラインに従って承認され、実施されました。研究ツールの詳細については、 資料表をご覧ください。

1. 記録室の準備

1. 半六角形のタンク、ベースプレート、ヘッドステージを準備します(図1A;補足ファイル1-3)。ヘッドステージは、円形のプレートに取り付けられた2本の金属製の支柱で構成されています。円形プレートには、ベースプレートにロックできる溝が含まれています。一緒にロックされた後、ヘッドステージとベースプレートは半六角形のタンクの底に置かれます。
2. 半六角形のタンクを顕微鏡の実験台に置きます。プラットフォームは、平行移動ステージの限界に達することなく、X方向とY方向に移動できる必要があります。
3. 810nmの赤外線(IR)ライトとカメラをヘッドステージに向け、行動を記録します。カメラの視野が大人のゼブラフィッシュが収まるのに十分な大きさであることを確認してください。
   1. 2光子レーザーと視覚刺激が行動記録に干渉しないように、カメラの前にそれぞれ875nmのショートパスフィルターと700nmのロングパスフィルターを設置します。
4. 視覚刺激を与えるために、半六角形の....

ディスカッション

ここでは、ゼブラフィッシュの成体であるゼブラフィッシュの頭部を拘束し、2光子カルシウムイメージングを行うための詳細なプロトコルについて説明します。レーザースキャニングイメージングに十分な安定性を備えたヘッドレストを実現するには、2つの重要なステップがあります。まず、ヘッドバーを頭蓋骨の特定の取り付け部位に接着する必要があります。頭蓋骨の他の部分は、機?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition card	MBF Bioscience	Vidrio vDAQ	Microscope
Back-projection film	Kimoto	Diland screen - GSK	present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm)	Chroma	ET510/80m	Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Camera filter (<875 nm)	Edmund optics	#86-106	Behavior recording
Camera filter (>700 nm)	Edmund optics	#43-949	Behavior recording
Camera lens	Thorlabs	MVL50M23	Behavior recording
Chameleon Vision-S	Coherent	Vision-S	Laser
Circular plate for the head stage	custom made	see supplemental files	recording chamber
Controller for piezo actuator	Physik Instrumente	E-665. CR	Microscope
Current amplifier	Thorlabs	TIA60	Microscope
Elitedent Q-6	Rolence Enterprise	Q-6	Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm	Chroma	ET510/80m	Microscope
Head bar	custom made	see supplemental files	recording chamber
Infrared light	Thorlabs	M810L3	Behavior recording
LED projector	AAXA	P2B LED Pico Projector	present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe)	Kimtech Science	34155	Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage	Zaber	X-LRM050	Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission)	Thorlabs	NE203B	present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder	ThorLabs	PH1.5V	Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post	ThorLabs	TR150/M	Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA	Nikon	CF175	Microscope
Oil-based modeling clay	Ly Hsin Clay	C4086	Surgery: head bar holder
Optical adhesive	Norland Products	NOA68	Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H11706P-40	Microscope
Piezo actuator	Physik Instrumente	P-725.4CA PIFOC	Microscope
Pockels Cell	Conoptics	M350-80-LA-BK-02	Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm)	Edmund optics	#53-699	present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System	INSS	RGE-02	Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	RA90/M	Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	SWC/M	Surgery: fish loading module
ScanImage	MBF Bioscience	Basic version	Microscope
Semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Super-Bond C&B Kit	Sun Medical Co.	Super-Bond C&B	Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Surgery: anesthetic
USB Camera	FLIR	BFS-U3-13Y3M-C	Behavior recording
Vetbond	3M	1469SB	Surgery: tissue glue