間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

要約

間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植して軟骨内骨化術を行う骨治療は、従来の治療法の欠点を回避できる可能性があります。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、均一に分化した軟骨移植片のスケールアップや、 in vivoでの融合移植片間の血管新生を伴う統合骨の形成に効果的です。

要約

間葉系幹細胞(MSC)を用いた従来の骨再生療法は、血管新生を誘導するメカニズムがないため、臨界サイズ以上の骨欠損への適用が困難でした。間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植すると、軟骨内骨化(ECO)を介して in vivo で血管新生と骨形成が誘導されます。したがって、このECOを介したアプローチは、将来的に有望な骨再生療法になる可能性があります。このECOを介したアプローチの臨床応用の重要な側面は、骨欠損を修復するために移植するのに十分な軟骨を準備するためのプロトコルを確立することです。特に、実際の骨欠損の形状に適合するサイズの移植軟骨の単一の塊を設計することは現実的ではありません。そのため、移植する軟骨は、複数個を移植した際に一体的に骨を形成する性質を持っている必要があります。ハイドロゲルは、軟骨内骨化のための組織工学的移植片をスケールアップして臨床要件を満たすための魅力的なツールである可能性があります。多くの天然由来のハイドロゲルは、 in vitro でのMSC軟骨形成やin vivoでのECO形成をサポートしますが、臨床応用のニーズを満たす最適な足場材料はまだ決定されていません。ヒアルロン酸(HA)は、軟骨の細胞外マトリックスの重要な成分であり、生分解性で生体適合性の多糖類です。本研究では、HAハイドロゲルが間葉系幹細胞ベースの軟骨組織の in vitro 分化をサポートし、 in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた特性を有することを示しました。

概要

自家骨は、外傷、先天性欠損、外科的切除による骨欠損を修復するためのゴールドスタンダードです。しかし、自家骨移植には、ドナーの痛み、感染のリスク、患者から分離できる骨量の制限など、重大な制限があります1,2,3,4。天然または合成ポリマーとリン酸カルシウムやハイドロキシアパ^{タイトなどの}鉱化材料を組み合わせた骨代替物として、数多くの生体材料が開発されています^5,6。これらの人工材料における骨形成は、通常、幹細胞が膜内骨化(IMO^{)プロセスを通じて}骨芽細胞に直接分化することを可能にするプライミング材料として、石灰化材料を使用して達成される7。このプロセスは血管新生ステップを欠いており、移植後の移植片のin vivo血管新生が不十分であり8,9,10、したがって、そのようなプロセスを使用するアプローチは、大きな骨欠損の治療に最適ではない可能性があります

プロトコル

このプロトコルでは、4週齢の雄のヌードマウスを使用します。4匹のマウスをケージに入れ、22〜24°C、相対湿度50%〜70%で12時間の明暗サイクルで飼育します。動物実験は、東京医科歯科大学動物実験委員会が承認したガイドライン(承認ID:A2019-204C、A2020-116A、A2021-121A)に準じて実施しました。

1. 緩衝液および試薬の調製

1. 間葉系幹細胞増殖培地(MSC増殖培地)をMSC基礎培地にMSC増殖培地のサプリメントキットを添加し、4°Cで保存します。
2. 10%ウシ胎児血清(FBS)、50 μg/mLゲンタマイシン、200 μM L-アラニル-L-グルタミン、および1 ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子を培地に添加して、ダルベッコ改変イーグル培地およびハムF12(DMEM/F-12)培地を調製し、4°Cで保存します。
3. 使用直前に、1% ITS-Gサプリメント、0.12%ウシ血清アルブミン、50 μg/mLゲンタマイシン、0.35 mM L-プロリン、100 nMデキサメタゾン、および10 ng/mL TGF-β3をDMEMに添加して、軟骨形成培地を調製します。
4. 使用直前に、10 mM β-グリセロリン酸、0.12% ウシ血清アルブミン、10 nM デキサメタゾン、200 μM アスコルビン酸-2-リン酸、50 nM L-チロキシン、50 μg/....

ディスカッション

肥厚軟骨から骨への移行を促進する適切な足場材料を使用することは、MSCベースの人工肥厚軟骨移植片をスケールアップし、臨床的に有意なサイズの骨欠損を治療するための有望なアプローチです。本研究では、HAがin vitroでMSCベースの肥大軟骨組織の分化をサポートし、in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた足場材料であることを示しています³⁸。さらに、

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basic fibroblastic growth factor	Reprocell	RCHEOT002
bovine serum albumin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	C10283
dexamethasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
Gentamicin sulfate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G supplement	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (×100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332