ウサギの変形性膝関節症モデルにおける鍼切開術の適用

要約

このプロトコルでは、変形性膝関節症モデルが修正された Videman 法を使用して作成され、鍼切開術の操作手順と注意事項が詳細に説明されています。鍼切開術の有効性は、大腿四頭筋と腱の機械的特性と軟骨の機械的および形態学的特性をテストすることによって実証されています。

要約

変形性膝関節症(KOA)は、整形外科で最も頻繁に遭遇する疾患の1つであり、KOA患者の生活の質を著しく低下させます。いくつかの病原性因子の中で、膝関節の生体力学的不均衡はKOAの主な原因の1つです。鍼術学は、膝関節の機械的バランスを回復させることがKOA治療の鍵であると考えています。臨床研究では、鍼切開術は、膝関節周辺の筋肉や腱の癒着、軟部組織の拘縮、応力集中点を減らすことにより、痛みを効果的に軽減し、膝の可動性を向上させることができることが示されています。

このプロトコルでは、修正されたVideman法を使用して、左後肢をまっすぐな位置に固定することによりKOAモデルを確立しました。大腿四頭筋や大腿四頭筋、大腱の力学、軟骨の力学や形態の検出を通じて、「骨疾患を治療するための筋肉と腱の調節」の理論と併せて鍼切開術の有効性を評価しました。その結果、鍼切開術は、膝関節周辺の軟部組織の機械的特性を調整し、軟骨応力環境を改善し、軟骨の変性を遅らせることで、軟骨を保護する効果があることを示しています。

概要

変形性膝関節症(KOA)は、変形性膝関節症の最も頻繁な形態であり、関節軟骨変性を特徴とする関節全体の疾患として認識されることが多く、臨床的には罹患した関節の痛み、腫れ、および動きの制限として現れ^ます1。最近の疫学統計によると、KOAは2020年までに世界で40歳以上の6億5,410万人に影響を及ぼしたと報告されています。KOAの有病率と発生率は年齢とともに上昇し、中高年で最も高く、男性よりも女性に多く罹患しています²。KOAの有病率は、世界的な高齢化と肥満の蔓延により増加する可能性があり、世界の公衆衛生に対する脅威が高まっています。年齢、性別、肥満、外傷、およびKOAに関連するその他の複雑な危険因子はすべて、膝の不安定性に直接影響し、膝関節の生体力学的不均衡をKOA^の主な原因の1つにします3。

通常の生理学的条件下では、膝関節は機械的バランスの状態にあり、関節内の機械的負荷が軟骨に均等に分散されます。膝関節の機械的不均衡は、軟骨に異常なストレスを与え、軟骨の変性や^KOA4の発症につながる可能性があります。筋腱系は、膝関節の機械的バランスを維持する主要な動的システムです。伸筋と屈筋腱系の協調的な動きは、軟骨表面の動きによって発生する負荷を均等に分散することができ、軟^骨の喪失をもたらす生理学的負荷を超える局所的な軟骨ストレスの代謝の不均衡を回避します5。筋力の低下は、筋肉内運動障害および軟骨損傷の主な原因であり、症候性KOAの前に発生する可能性があります。

KOAはまた、関節形成性筋抑制(AMI)を誘発し、膝周りの筋力低下や筋力低下として現れることがあります⁶。これらの筋肉の中で、大腿四頭筋群は唯一の膝伸筋として機能し、膝関節の安定性を維持する上で重要な構造です。研究によると、大腿四頭筋の断面積と筋力の減少は、KOAの進行と有意かつ正の相関があることが示されています⁷。大腿四頭筋の筋力の低下は、歩行パターン、膝の安定性、運動パターン、および他の多くの機能に影響を与えます。さらに、筋力の低下は腱機能を損ない、腱の硬さ、弾性率、およびその他の生体力学的特性の低下として現れます⁸。長期の緊張修復では、膝関節の筋肉や腱に癒着や拘縮などの変化が起こり、その機械的性質が損なわれ、関節が不安定になり、最終的にはKOAの病理学的変化の悪循環を形成することがあります。したがって、KOA治療では、筋腱系の機械的特性を改善し、関節の機械的バランスを回復することが重要です。

KOAの原因の中で、生体力学的不均衡は、膝の痛み、機能障害、炎症性病変、軟骨変性の主な誘発因子です⁹。したがって、KOA治療の鍵は、膝関節の生体力学的バランスを回復させることです。鍼術学は、KOAの病因と病因は「機械的不均衡」であると考えています。膝周りの軟部組織の機械的特性が異常に変化すると、膝関節は機械的バランスを失い、関節の異常な機械的ストレス環境は変性を加速させ、炎症刺激を引き起こして軟部組織の癒着をさらに悪化させ、拘縮し、関節の安定性をさらに低下させます。この悪循環がやがてKOAへと発展していく。鍼切開術は、軟部組織の癒着や拘縮を緩め、筋肉や腱へのストレス集中を抑えることで、「筋肉や腱を調節して骨疾患を治療する」という理論と組み合わせることで、軟部組織の力学を改善し、「筋肉や腱を調節する」ことで、関節の機械的ストレスのバランスを取り、軟骨の変性を効果的に緩和し、「骨疾患の治療」を行います¹⁰.動物モデルの選択にあたっては、本研究の目的を踏まえ、左後肢伸展固定の修正Videman法によりKOAモデルを作製した。

本稿では、左後肢伸展固定の修正Videman法を用いたKOAモデルの確立と、鍼切開術の手術方法と注意点について詳述する。大腿四頭筋と大腿四頭筋の機械的特性をテストし、関節軟骨のストレスと形態の変化を検出することにより、鍼切開術の有効性を実証します。

プロトコル

すべての動物実験は、北京中医薬大学の動物倫理委員会(No.BUCM-4-2022010101-1097)です。このプロトコルでは、生後6週齢の雄のニュージーランドウサギ24匹を、20〜25°C、湿度50〜60%、概日周期12時間/暗12時間という特定の条件下で飼育し、通常のチャウ食を自由に摂取できるようにしました。ウサギは麻酔をかけられ、深い麻酔と空気塞栓術を組み合わせて犠牲にされました。疼痛はKOAの典型的な病理学的特徴の1つであり、KOAの動物モデルや介入方法を評価するために使用される重要な指標の1つでもあるため、モデル作成中に鎮痛薬は使用されません。

1. KOAウサギモデル

1. ウサギに3%ペントバルビタールナトリウム(30 mg / kg)を耳の縁に静脈内投与します。.適切なレベルの麻酔を確認するには、角膜反射が著しく弱まっているか、または存在しないか、止血鉗子で皮膚を締め付けたときに痛みがないことを確認します。麻酔中は、ウサギの目が乾燥するのを防ぐために、15分ごとに2〜3滴の潤滑剤をウサギの目に加えます。
2. 麻酔後、各ウサギを仰臥位に固定し、左後肢を完全に伸ばした位置に引っ張ります。
3. 各ウサギの左後肢を伸ばした位置に固定します。
   1. 最初の層として、医療用テープを使用して、鼠径部から足首関節までのウサギの皮膚を覆います。
   2. 2層目は、医療用テープの上に36mm幅の両面フォームテープを巻き付け、鼠径部から足首関節までポリマー包帯を巻き付けます。膝関節が180°まっすぐで、足首関節が60°背屈していることを確認してください。
   3. 3層目は、膝関節と足首関節の前後に小さな添え木で関節を固定し、最外層にスチールメッシュを巻き付けて噛みつきから保護します。ウサギのつま先を露出させて、血液循環が正常かどうかを観察します。
4. 動物を6週間固定して、KOAモデルを確立します(図1)。
   注:1)モデルの準備中は、一日おきに金型を検査してください。カビが緩んだり外れたりした場合は、ウサギに麻酔をかけ、左後肢を伸ばした姿勢で再び固定します。2)ケージの底に保護マットを敷いて、ウサギの手足が引っかかって怪我をしないようにします。

2.鍼切開介入

注:鍼切開介入の開始前に、耳の縁静脈内注射により、3%ペントバルビタールナトリウム(30 mg / kg)でウサギに麻酔をかけます。.

1. 治療のポイントを決定します。
   1. ウサギの左後肢の膝関節の毛皮を剃ります。
   2. ウサギの膝関節内側大腿筋腱挿入、直腸大腿腱挿入、大腿二頭筋腱挿入、およびガチョウ足滑液包を触診します。局所筋肉の病理学的硬結を滅菌皮膚マーカーでマークします。膝関節を医療用ヨードフォアと75%医療用アルコールを交互に3回消毒します。
2. 鍼切開術の手術
   1. 鍼切り刃を進行方向と平行に保ち、腱と四肢の縦軸と平行に保ちます。
   2. 左手の親指でマーカーポイントに入る皮膚を押し下げ、親指の腹側で血管と神経が分離するように横方向に動かします。
   3. 鍼切りのハンドルを右手に持って、鍼切りの刃が瞬時に皮膚を通過するように、小さな力ですばやく押し下げます。鍼切開の刃を局所的な筋肉の硬結にゆっくりと前進させ、縦方向に切り込み、横方向にスイングします。
   4. 鍼切開手術が終わったら、再度膝関節を消毒し、絆創膏を貼ります。
3. この操作を週に1回、4週間行います(図2)。
   注:1)内側広筋、外側広筋、大腿直筋、大腿二頭筋、またはアンセリン滑液包の腱挿入時に硬結またはコード状組織が触れていない場合は、鍼切針を使用して腱挿入を直接解放する必要があります。2)鍼切開介入中、鍼切開群のウサギの左後肢およびモデル群の伸展姿勢を固定しないでください。

3.大腿四頭筋の弾性率

注:1)この実験では、リアルタイム横波エラストグラフィ(SWE)超音波診断装置を使用して、ウサギの各グループの大腿四頭筋の弾性率をin vivoで測定しました。2)テスターは、超音波検出の経験豊富な超音波検査技師である必要があります。測定するときは、局所的な筋肉の緊張を避けるために、超音波プローブを大腿四頭筋の皮膚表面にそっと置く必要があります。測定は、動物がもがいたり活動したりすることなく、静かな状態にあるときに行う必要があります。動物が活動している場合は、落ち着くまで待ってからテストを行ってください。

1. 毛皮を剃って、左後肢の大腿四頭筋部分の皮膚を露出させます。
2. 従来の2次元超音波を使用して、大腿四頭筋腹部の位置を特定し、1〜2cmの深さに設定して関心領域(ROI)を決定します。
3. 検査のために SWEモード を開始します。
   1. 関心領域を直径2mmの円形領域に均一に設定し、関心領域を皮膚の表面から~0.5〜1cmの深さに設定します。
   2. 超音波診断装置を使用して、音響放射力インパルスを生成して筋肉組織を刺激し、組織エラストグラフィを取得します。
   3. 画像が安定するまで2〜3秒待ってから、画像をフリーズします。機器の Q-BOX 機能をアクティブにして、大腿四頭筋のヤング率を測定します。
   4. ROIのヤング率の最大値、最小値、平均値(単位:KPa)が自動的に計算されるのを待ちます。3 つの測定に対して同じ深さの 3 つの ROI を選択し、統計分析のために平均値を取得します。
      注意: テスターは、超音波検出の経験豊富な超音波検査技師である必要があります。測定するときは、局所的な筋肉の緊張を避けるために、超音波プローブを大腿四頭筋の皮膚表面にそっと置く必要があります。測定は、動物がもがいたり活動したりすることなく、静かな状態にあるときに行う必要があります。動物が活動している場合は、落ち着くまで待ってからテストを行ってください。

4. 大腿四頭筋の収縮力の測定

注:大腿四頭筋の収縮力を測定した後、ウサギは麻酔下で空気塞栓術によって安楽死させました。

1. ウサギを3%ペントバルビタールナトリウム(30 mg / kg)で耳の縁に静脈内麻酔します。.適切なレベルの麻酔に達したことを確認するには、角膜反射が著しく弱まっているか、または存在しないか、止血鉗子で皮膚をクランプしたときの痛みがないことを確認します。麻酔中は、ウサギの目が乾燥するのを防ぐために、15分ごとに2〜3滴の潤滑剤をウサギの目に加えます。
2. 大腿四頭筋を露出させ、張力トランスデューサーを取り付けます。
   1. 膝蓋骨の下の皮膚を、手足の縦軸に沿って太ももの付け根まで上向きに切り、皮膚を上向きに3〜4cm切り続けます。皮膚と筋膜を慎重に剥がし、筋肉を露出させます。膝蓋靭帯を切断し、大腿四頭筋を腸骨接合部から慎重に分離し、大腿四頭筋を腸骨と接続させます。
   2. 膝蓋骨と大腿四頭筋の間の腱接合部に外科的縫合糸を結紮します。筋肉を自然な状態で全長まで伸ばし、張力トランスデューサーに取り付けます。筋肉の結紮線を力変換器の結紮線と一直線に保ちます。
   3. 張力トランスデューサをブラケットに固定します。張力トランスデューサの信号取得ラインを生体信号取得システムプロセッサに接続します。
3. 大腿四頭筋の収縮性能を測定します。
   1. 電極を大腿四頭筋の腹部と平行に挿入し、電極間の接触を避けます。
   2. オシロスコープのボタンを押します。ブラケット上の力変換器の位置を調整して、ベースラインをゼロに保ちます。波幅5ms、遅延10msのスティミュレータのスティミュレータパラメータを選択します。
   3. 最初に単一の刺激を使用し、刺激強度をゼロから0.1Vずつ徐々に調整します。大腿四頭筋の最大単一収縮振幅(Pt)が決定されるまで、筋収縮曲線と収縮振幅の変化を観察します。後続の統計のために記録します。
   4. クラスター刺激を使用し、最大単一収縮振幅を誘導する刺激振幅をベースラインとして使用して、筋肉を連続的に刺激し、刺激周波数を徐々に増やします。大腿四頭筋の最大収縮振幅(Pt)が決定されるまで、筋収縮曲線の変化を観察します。後続の統計のために記録します。
      注:1)各筋肉収縮の後、筋肉に30秒を与えてリラックスさせ、筋肉緩衝液を筋肉に継続的に滴下する必要があります。2)手術中、ウサギのまぶた反射、呼吸リズム、筋弛緩、皮膚つまみ反応をモニタリングし、麻酔状態を判断する。

5.大腿四頭筋腱の機械的性能

1. 前処理:試験当日、ノギスで大腿四頭筋腱の長さ、幅、厚さを測定し、疲労試験機に専用の滑り止めクランプを取り付けます。前処理のために15回ロードとアンロードを繰り返します。
2. 応力緩和試験:0Nから100Nの範囲のセンサーを使用し、必要な長さに達するまで5mm / minの速度で引き伸ばしてから、データ収集を開始します。コンピュータのデータ取得時間をt(0)から設定し、0.1秒ごとにデータを収集し、1,800秒間持続します。設定時間に達したら、データと曲線を記録します。
3. 引張試験:0 Nから100 Nの範囲のセンサーを使用し、試験片が引き離されるまで最大荷重まで5 mm / minの速度で引き伸ばします。試験後、試験片の最大変位、極限荷重、剛性を計算します。

6.関節接触面圧と軟骨の単位面積あたりの圧力

1. 大腿骨と脛骨の両側の試験片を治具のまっすぐな位置に固定し、予圧試験を行います。膝関節のおおよその範囲を測り、感圧紙を同じ形に切り、ラップで密封します。
2. 密封した感圧紙を脛骨関節と大腿骨関節の間に置き、膝関節に圧力5mm/min、最大圧力50Nの圧力試験を行います。 粘圧紙が安定して着色する50Nに達するまで2分間圧力を維持します。
3. 2分経過したら、感圧紙を取り出し、A4サイズの用紙に着色面を固定し、目盛りを置いて画像を取得します。
4. 画像をコンピューターにアップロードします。面積測定と不規則な図形のマルチセグメント測定には、参照ソフトウェアを使用します。大腿骨と脛骨の関節の内側と外側の圧力を測定し、結果を記録します。

7.膝関節軟骨のサフラニンO /ファストグリーン染色

1. 鍼切開術の介入が終了した後、軟骨 - 軟骨下骨複合体組織を採取し、パラフィンに埋め込みます。準備したティッシュワックスブロックをスライスし、スライドを準備します。調製した組織スライドを環境脱ろう溶液(I)および環境脱ろう溶液(II)でそれぞれ15分間脱パラフィンします。次に、キシレンと無水エタノール(1:1)、無水エタノール(I)、95%エタノール、85%エタノール、および75%エタノールに、各ステップで2〜5分間連続して浸します。最後に、蒸留水に15分間浸します。
2. 染色を行います。
   1. スライドをFast Green溶液で1分間染色します。このプロセスでは、スライドを溶液から取り出し、組織が濃い緑色に染まるまで顕微鏡で観察します。
   2. 色分解:余分なFast Green溶液を超純水ですすいでください。スライドを1%酢酸溶液に5〜10秒間すばやく浸します。 再度、スライドを超純水ですすいでください。
   3. 軟骨が赤く染まるまで、スライドをサフラニンO溶液で10〜15分間染色します。
3. 組織を脱水して清澄化し、スライドガラスを密封し、顕微鏡で観察します。
   1. スライドを75%エタノール、85%エタノール、95%エタノール、100%エタノールに3〜5秒間連続して浸します。
   2. スライドを環境脱ろう液(I)と環境脱ろう液(II)に連続して10分間浸します。スライドを取り出し、ティッシュを避けてスライドの前面に中性樹脂媒体を落とします。カバーガラスの端をスライドに置き、ゆっくりと置いて中性バルサムを覆います。空気を抜き、気泡を避けてください。余分なキシレンと中性バルサムを拭き取り、室温で一晩放置します。
   3. スライドを顕微鏡で観察し、画像を取得します。各グループについて、ウサギの膝軟骨のサンプルを6つ選択し、評価のためにサンプルごとに4つの異なる視野をランダムに選択します。Mankin法に従って各グループの軟骨組織型をスコアリングします(表1)。

8. 統計解析

1. データを平均±標準偏差 ( ± s) として表します。
2. 多重群比較の統計的有意性を判断するために、一元配置分散分析(ANOVA)とLSDの検定を実行します。
3. P が 0.05 の場合、統計的に有意な差<考えます。

結果

大腿四頭筋と大腿四頭筋の機械的性質の実験結果
KOAのウサギの大腿四頭筋の機械的特性に対する鍼の効果を評価するために、リアルタイム横波弾性超音波画像法と筋緊張トランスデューサーをそれぞれ使用しました。対照群と比較して、KOA群の大腿四頭筋のヤング率は低下した(P < 0.05)。KOA群と比較して、鍼切開群のヤング率は増加した(P < 0.05、 ?...

ディスカッション

適切な動物モデルは、実験目的を達成し、特定の科学的問題を明確にするための重要な要素の1つです。本研究は、鍼切開療法における「骨と関節の潤滑」と「機械的不均衡」の理論に基づき、鍼切開療法における「筋肉と腱を調節して骨疾患を治療する」ことでKOA治療の背後にある科学的意味合いを説明することを目的とした。つまり、鍼切開術は、膝周りの軟部組織の機械的特性を調節し...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acupotomy	Beijing Zhuoyue Huayou Medical Devices Co., Ltd.		0.4 x 40 mm
Connect Cast Orthopedic Casting Tape	Suzhou Connect Medical Technology Co.,Ltd.	KCP06	15.0 cm x 360 cm
Double-sided Foam Tape	Deli Group Co.,Ltd.	NO.30416	36 mm x 5 yard x 2.5 mm
Environmental Dewaxing Solution	Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd.	G1128
Ethanol absolute	Beijing Hengkangda Medicine Co., Ltd.
Fast Green solution	Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd.	G1031
Fast grenn FCF	Sigma,America	2353-45-9
Fatigue testing machine	BOSE, America		Bose Electro Force 3300
Four-channel physiological recorder	Chengdu Instrumeny Frctory		RM-6420
FPD-305E	Fuji, Japan
FPD-306E	Fuji, Japan
Hematoxylin solution	Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd.	G1005
Medical iodophor disinfectant	Shan Dong Lircon Medical Technology Co., Ltd.
Medical Tape	Shandong Rongjian Sanitary Products Co., Ltd.	200402	1.5 x 500 cm
Muscle tension transducer	Chengdu Instrumeny Frctory		JH-2204005, 50 g
Prescale	Fuji, Japan
Real-time SWE ultrasound diagnostic instrument	SuperSonic Imagine SA,France		SuperSonic Imagine AixPlorer
Rhamsan gum	Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd.	WG10004160
Safranine O	Sigma,America	477-73-6
Safranine O solution	Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd.	G1015
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS)	IBM, America