メタゲノムアンプリコンシーケンシングを用いたワイン生産中の発酵トラミネットブドウの細菌群集のプロファイリング

要約

ここでは、トラミネットブドウ、発酵ブドウ、および最終ワインの細菌群集を決定するためのアンプリコンメタゲノムを説明するためのプロトコルを提示します。

要約

シーケンシング技術の進歩と、微生物群集構造をプロファイリングするためのバイオインフォマティクスツールの使用が比較的容易になったことで、ブドウとワインの培養可能な微生物と培養不可能な微生物の両方についての理解が深まりました。工業的発酵では、既知および未知の微生物が、製品開発や異臭の原因となることがよくあります。したがって、ブドウからワインまでの細菌をプロファイリングすることで、in situ微生物の動態を簡単に理解することができます。この研究では、トラミネットブドウのバクテリアを発酵させ、最終的なワインをDNA抽出し、15 ng / μLから87 ng / μLを生成しました。V4領域の超可変領域の16Sアンプリコンは、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリオタ門、ファーミキューテス門、バクテロイドタ門、フソバクテリオタ門からなる比較的豊富な細菌を配列決定し、続いて疣贅微生物叢、ハロバクタタ門、デスルホバクタ門、粘液球菌門、およびアシドバクテリオタ門が続いた。共通の固有分類単位(OTU)のベン図分析により、ブドウの果汁、発酵段階、最終ワインの両方に共通する15の細菌門が明らかになりました。これまで報告されていなかった門は、16Sアンプリコンシーケンシングを用いて検出されたほか、腸内細菌科や乳酸菌科などの属も検出されました。ワインの有機栄養素の使用の変動とバクテリアへの影響がテストされました。Fermaid OとTraminette LをStimula Sauvignon blanc + Fermaid Oで刺激したTraminette Rタンクは、Kruskal-Wallisテストを使用したアルファ多様性により、均一性の程度を決定しました。ベータの多様性は、2つの処理の発酵段階でのバクテリアの変化を示しており、最終的なワインバクテリアは類似しているように見えました。この研究では、16Sアンプリコンシーケンシングを使用して、ワイン製造中の細菌の変化を監視し、ワイン製造中のブドウ細菌の品質とより良い利用をサポートできることが確認されました。

概要

トラミネットのブドウは、かなりの収量といくつかの真菌感染症に対する部分的な耐性に加えて、優れたワイン品質の生産を特徴としています^1,2,3。葡萄の自然発酵は、関連する微生物、ワイン生産環境、および発酵容器に依存しています^4,5。多くの場合、多くのワイナリーは、発酵、アルコールの生産、エステル、香り、^{風味の開発を}野生酵母とバクテリアに依存しています6。

この研究の目的は、ブドウの細菌組成を調べ、発酵中のブドウの動態を監視することです。ただし、アルコールが生成される一次発酵に出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)などのスターター培養を現代的に使用することは、さまざまなワインスタイルに共通しています⁷。さらに、リンゴ酸がオエノコッカス・オエニによって乳酸に脱炭酸される二次発酵は、ワインの官能と味のプロファイルを改善し、ワインの酸味を減らします^8,9

プロトコル

1. 実験的なワイン生産

1. ノースカロライナ州ジョーンズビルのブドウ園にあるデュナミスエステートワインからトラミネットブドウを入手し、除梗、粉砕してマストを2つの別々の600Lオープントップ発酵槽に放出し、蓋をした状態で約4日間皮に置きます。
2. 1日1回キャップを打ち抜いて、肌を濡らさず、揮発性酸(VA)の生成を制限します。
   注:多くの芳香族前駆体(モノテルペン)が皮にあり、果汁を皮に接触させてワインの芳香の可能性を高めるという考え方です。
3. 4日後、 Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23(Lallemand)をピッチングする。この酵母は、強力な発酵槽であり、ブドウからワインの品種の特徴を高めることに関連しているため、選択されました。
4. 一方のタンクであるトラミネット Rには、ブリックスが17.7のときに20 g/hLのフェルメイドO、13.1 g/hLのときに20 g/hLのフェルメイドOと12.5 g/hLのフェルメイドKを加えて発酵の安全性を確保し、もう一方のタンクのトラミネット Lは、ブリックスが17.1のときに40 g/hLのスティミュラ・ソーヴィニヨン・ブランを加えます。また、ブリックスが13.4のときに20 g/hLのフェルメイドOを加えて、ワインの品種....

ディスカッション

メタゲノミクスのプロトコルは、ブドウの果汁のサンプリングから始まり、酵母がマストに加えられたとき、発酵ワインと最終的なワインのサンプル。これに続いて、これらのサンプルから抽出されたDNAの複製抽出に成功しました。得られた濃度は15 ng/μLから87 ng/μLまでさまざまでした。これはDNAの抽出のプロトコルがワインのmetagenomicの調査のために有効であることを示す。A260/A280のDNAの?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation