脳波記録中のラットの側尾静脈からの脳脊髄液および血液のサンプリング

要約

プロトコルは連続的なビデオ脳波(EEG)のモニタリングと並行して行なわれるてんかんラットからの繰り返された脳脊髄液および血のコレクションを示す。これらは、さまざまな体液分子の変化と発作活動との関連性を探るのに役立ちます。

要約

体液の組成は多くの生理学的および病理学的動態を反映しているため、ホルモン、成長因子、タンパク質、低分子ノンコーディングRNAなどの目的の分子を測定するために、多くの実験状況で生体液体サンプルが一般的に採取されます。具体例としては、てんかんのバイオマーカー研究における生体液のサンプリングがあります。これらの研究では、脳脊髄液(CSF)と血漿中の分子のレベルを比較することが望ましいです。てんかん動物におけるビデオ脳波モニタリングと組み合わせたCSFと血漿サンプリングの組み合わせは、推定診断および予後バイオマーカーの検証のための有望なアプローチです。ここでは、てんかんラットの大槽からのCSF離脱と側尾静脈からの採血を組み合わせた手順を、ビデオ脳波を継続的にモニターする手順について説明します。この手順には、一般的に使用される他の手法に比べて大きな利点があります。痛みや侵襲性を最小限に抑え、麻酔時間を短縮した迅速なサンプリングを可能にします。さらに、テザーおよびテレメトリーEEG記録ラットの両方でCSFおよび血漿サンプルを取得するために使用でき、数日間の実験で繰り返し使用できます。イソフルラン麻酔を短くすることでサンプリングによるストレスを最小限に抑えることで、生体液中の調査分子の真のレベルをより正確に反映する測定が期待されます。適切な分析アッセイの利用可能性に応じて、この技術を使用して、同時に脳波記録を実行しながら、複数の異なる分子のレベルを測定することができます。

概要

脳脊髄液(CSF)と採血は、前臨床研究と臨床研究の両方で、てんかんのバイオマーカーを特定および検証するために重要です^1,2。現在、てんかんの診断とてんかんバイオマーカーに関する研究のほとんどは、脳波と神経画像に焦点を当てています^3,4,5。ただし、これらのアプローチにはいくつかの制限があります。日常的な頭皮測定とは別に、多くの場合、EEGには深層電極⁶のような侵襲的な技術が必要です。脳イメージング法は、時間分解能と空間分解能が低く、比較的高価で時間がかかります^7,8。このため、非侵襲的で低コストの生体液ベースのバイオマーカーの同定は、非常に魅力的な代替手段となります。さらに、これらの生体液バイオマーカーは、利用可能な診断アプローチと組み合わせることで、予測可能性を高めることができます。

てんかんと診断された患者は、日常的に脳波^9,10と採血

プロトコル

すべての実験手順は、1986年11月24日の欧州共同体理事会指令(86/609/EEC)の実験およびその他の科学的目的で使用される動物の保護に関するガイドラインに従って、フェラーラ大学施設動物管理および使用委員会およびイタリア保健省(認可:D.M.603/2022-PR)によって承認されています。このプロトコルは、てんかん動物のEEG制御下で得られたラットCSFおよび血漿中の小さな非コーディングリボ核酸(sncRNA)のさらなる定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析のために特別に調整されます。オプションで、手術^19、20、21の理解と改善のために、関連するJoVEビデオをご覧ください。

1.電極またはテレメーターの外科的移植のための動物の調製

注:脳定位固定装置の手術方法は、使用する脳波システムによって異なります。次の方法のセクションでは、2 種類の手術に共通する手順について説明します。

1. 実験動物の世話と使用に関する現地の法律に従って維持されているSprague-Dawley(SD)ラット(オス、7〜8週齢、体重250〜290 g)を使用してください。動物を標準的な条件で飼育し、....

ディスカッション

本研究は、ラットにおけるCSFと採血の習得が容易な手法を示しており、てんかんのモデルだけでなく、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症などの他の神経疾患や疾患の研究にも有用である可能性がある。てんかんの研究では、さまざまな可溶性分子のレベルと発作活動の間の相関関係を追求する場合、ビデオ脳波と組み合わせた両方のサンプリング手順が理想的です。この特?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok	BD Italy SpA, Milan, Italy	367246	Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E)	BD Italy SpA, Milan, Italy	365975	Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm	Nipro, Osaka, Japan	PSY-23-ET-ICU	Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R	DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England	112000033	Material
Cotton suture 3-0	Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA	7343H	Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam	Dechra Veterinary Products, Torino, Italy	105183014 (AIC)	Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	PNM-VIDEO-008	Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up	EZVIZ Network, Hangzhou, Cina	EZVIZ (V5.3.2)	Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity	Laboratoire Garcin-Bactinyl, France	LB 920111	Solution
Dummy guide cannula 8 mm	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	CXD-8	Material
Electrode 3-channel two-twisted	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Electrode holder for stereotxic surgery	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	1776-P1	Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6137	Equipment
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL	Eppendorf Srl, Milan, Italy	30124332	Material
Eppendorf μCuvette G1.0	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6138	Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo	Zoetis, Rome, Italy	103287025 (AIC)	Solution
Ketamine (Imalgene)	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Lithium chloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	L9650	Material
Microinjection cannula 31G 9 mm	Agn Tho's, Lindigö Sweden	CXMI-9	Material
MP150 modular data acquisition and analysis system	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night	Ursapharm, Milan, Italy	941791927 (AIC)	Material
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	P6503	Material
PTFE Tube with joint	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	JT-10	Material
Saline	0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0		Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S2250	Material
Scopolamine methyl nitrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S1876	Material
Silver sulfadiazine 1% cream	Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy	025561010 (AIC)	Material
Simplex rapid dental methacrylic cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA	Model 963	Equipment
Sucrose solution	10% sucrose in distilled water	Home-made	Solution
Syringe 1 mL	Biosigma, Cona, Venezia, Italy	20,71,26,03,00,350	Material
Telemeters	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	CTA-F40	Material
Telemetry EEG traces analyzer	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	NeuroScore v3-0	Equipment
Telemetry system	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	Hardware plus software Ponemah core 6.51	Equipment
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	X1251	Material