腫瘍形成中の抗原特異的CD8+ T細胞の動態を評価するためのリンパ節転移モデル

要約

ここで提示する実験デザインは、リンパ節(LN)転移中の抗原特異的CD8⁺ T細胞の研究に有用な生殖モデルを提供し、傍観者CD8⁺ T細胞の摂動を排除します。

要約

リンパ節を排出する腫瘍抗原特異的CD8⁺ T細胞は、腫瘍形成中の抗腫瘍免疫応答のマウントにおいて重要性を増しています。しかし、多くの場合、がん細胞はリンパ節に転移性遺伝子座を形成してから、さらに遠隔臓器に転移します。局所的および系統的なCD8⁺ T細胞応答がLN転移によってどの程度影響を受けたかは不明のままである。この目的のために、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、糖タンパク質(GP)、およびクラスIの主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子H-2D^bによって提示されるGP由来ペプチドGP_33-41に特異的なT細胞受容体(TCR)を有するP14トランスジェニックマウスに由来する代理ネオアンチゲンを発現するB16F10-GPメラノーマ細胞株と組み合わせたマウスLN転移モデルを設定しました。このプロトコルはLNの転移の間に抗原特定のCD8⁺ T細胞の応答の調査を可能にする。このプロトコルでは、C57BL/6JマウスにB16F10-GP細胞を皮下移植し、その後、ナイーブP14細胞を養子移植しました。皮下腫瘍が直径約5mmに成長した時点で、原発腫瘍を切除し、B16F10-GP細胞を腫瘍排譚リンパ節(TdLN)に直接注入しました。次に、LN転移の過程でCD8⁺ T細胞の動態をモニターした。まとめると、このモデルは、LN転移中の抗原特異的CD8⁺ T細胞免疫応答を正確に調査するためのアプローチを提供しました。

概要

がん免疫療法、特に免疫チェックポイント遮断(ICB)は、がん治療に革命をもたらしました¹。ICBは、腫瘍微小環境(TME)の枯渇したCD8⁺ T細胞で高発現する共抑制性免疫受容体(PD-1、Tim-3、LAG-3、TIGITなど)を遮断し、枯渇したCD8⁺ T細胞の再活性化を引き起こします²。枯渇したCD8⁺ T細胞の不均一性を考慮すると、蓄積された証拠により、ドレナーギンパ節(dLN)を含む末梢に由来する腫瘍特異的CD8⁺ T細胞が、TMEには存在しないことが明らかになった^3,4,5,6,7,8。最近、TdLN由来のTCF-1⁺TOX^腫瘍特異的メモリーCD8⁺ T細胞(TdLN-T_TSM)は、従来のメモリーT細胞のいくつかの機能的特性を具現化し、ICB治療によりさらに増殖....

プロトコル

使用したC57BL/6Jマウス(B6マウスと呼ぶ)およびナイーブP14トランスジェニックマウス^9,27は、体重18〜22gの6〜10週齢であった。男性と女性の両方を無作為化または盲検化なしで組み入れた。すべての動物実験は、青島農業大学の動物実験委員会のガイドラインに従って実施されました。

1. 培地・試薬の調製

1. DMEM、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%L-グルタミンと追加の100 U/mLピューロマイシンを添加して、D10(完全DMEM培地)と名付けられたB16F10-GPメラノーマ細胞培養培地を調製します。滅菌済みのD10を維持し、2〜4°Cで最大2週間保管します。
2. RPMI-1640と2%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%L-グルタミンを添加して、R2培地(赤血球溶解の終了用)を調製します。
3. 2% FBSおよび0.01%のアジ化ナトリウムを含む1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を添加して、蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファーを調製します。アジ化ナトリウムの添加は、2〜4°Cで数ヶ月保存することができるFACS緩衝液の保存時間を延長することができる。
4. 155 mM NH_4....

ディスカッション

腫瘍形成の間、抗原提示細胞(APC)は腫瘍抗原を飲み込み、TdLNに移動してCD8⁺ T細胞をプライミングします。プライミングと活性化の後、CD8⁺ T細胞はTdLNを離れ、腫瘍に浸潤して腫瘍細胞を殺します¹⁰。リンパ器官からの免疫細胞の出口を遮断するTdLN切除とFTY720の投与を通じて、いくつかの研究がPD-1 / PD-L1チェックポイント療法の有効性を確保する上でTdLNの極め?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml