中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

要約

偽型ウイルス(PV)は、複製欠損のあるウイルス粒子であり、本物のウイルスを扱うよりも安全な条件下で宿主とウイルスの相互作用を研究するために使用されます。ここでは、SARS-CoV-2 PVを使用して、COVID-19ワクチン接種後の患者の血清の中和能力をテストする方法を示す詳細なプロトコルを紹介します。

要約

シュードタイプウイルス(PV)は、宿主とウイルスの相互作用を研究し、血清サンプルの中和能力をテストするために使用できる分子ツールであり、目的遺伝子を送達するための遺伝子治療での使用がよく知られています。PVは、ウイルスゲノムがPVに取り込まれない異なるプラスミドに分割されているため、複製に欠陥があります。この安全で汎用性の高いシステムにより、バイオセーフティレベル2のラボでPVを使用できます。ここでは、ここで述べた3つのプラスミドに基づいてレンチウイルスPVを産生する一般的な方法論を提示します:(1)感染を監視するために必要なレポーター遺伝子を運ぶバックボーンプラスミド。(2)PVを生成するために必要なすべての構造タンパク質の遺伝子を運ぶパッケージングプラスミド。(3)ウイルスの向性を決定し、宿主細胞へのウイルスの侵入を媒介するエンベロープ表面の糖タンパク質発現プラスミド。この研究では、SARS-CoV-2スパイクは、非複製性SARS-CoV-2偽型レンチウイルスの産生に使用されるエンベロープ糖タンパク質です。

簡単に説明すると、パッケージング細胞(HEK293T)を標準的な方法を用いて3つの異なるプラスミドと同時トランスフェクションしました。48時間後、PVを含む上清を回収し、ろ過し、-80°Cで保存した。 SARS-CoV-2 PVの感染力は、感染後48時間後の標的細胞株におけるレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)の発現を調べることによってテストされました。相対発光単位(RLU)の値が高いほど、感染/形質導入率は高くなります。さらに、感染性PVを段階希釈した血清サンプルに添加して、偽ウイルスが標的細胞に侵入する中和プロセスを調べ、RLU強度の低下として測定しました。

概要

偽型ウイルス(PV)は、微生物学において宿主ウイルスおよび病原体と病原体の相互作用を研究するために使用される分子ツールです^1,2,3,4。PVは、ウイルスゲノムを保護するウイルスコアである内側の部分と、ウイルスの表面にあるエンベロープ糖タンパク質である外側の部分から構成され、屈性を規定しています⁵。偽ウイルスは、新しいウイルス粒子を生成するためのすべての遺伝情報を含んでいないため、標的細胞内で複製する能力がありません。この独特な特徴の組み合わせにより、PVは野生型ウイルスの安全な代替品となります。一方、野生型ウイルスは病原性が高く、BSL2の検査室^{では分析に}使用できない6。

PVの感染力は、通常、蛍光タンパク質(GFP、RFP、YFP)または化学発光産物を産生する酵素(ルシフェラーゼ)をコードするレポーター遺伝子によってモニターできます。これは、PV産生に用いられるプラスミドの1つに含まれ、偽ウイルス⁷のゲノムに組み込まれる。

現在、HIV-1ゲノムに基づくレンチウイルス由来の粒子など、いくつかの種類のPVコアが存在します。HIV-1ベースのPVが他のプラットフォームよりも優れている点は、標的細胞ゲノム8への本質的な統合プロセス^です。HIV-1は感染力の強いウイルスであり、エイズの原因物質ですが、これらのレンチウイルスベクターは、長年にわたる広範な最適化ステップにより、安全に使用できます。最適な安全条件は、形質導入能力に影響を与えることなくウイルス遺伝子を枯渇させた第2世代レンチウイルスベクターの導入によって達成されました⁹。第3^{世代と第4世代は}、ウイルスゲノムを別々のプラスミドにさらに分割することで、レンチウイルスベクターの取り扱いの安全性の向上に貢献しました^10,11。最新世代のPVは、一般的に遺伝子治療用のレンチウイルスベクターの製造に用いられています。

PVは、ウイルスと宿主細胞の間の相互作用を研究するために、生産段階と感染段階の両方において使用できます。PVは、特に偽ウイルス中和アッセイ(PVNA)に用いられます。PVNAは、PVのエンベロープ上のウイルス糖タンパク質を標的とすることにより、血清または血漿の中和能を評価するために広く検証されています^12,13。中和活性は、阻害濃度50(IC50)として表され、ウイルス粒子の侵入の50%を遮断する血清/血漿の希釈として定義される¹⁴。このプロトコルでは、ブースターワクチンの接種前後に採取した血清中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)に対する抗体活性をテストするためのPVNAのセットアップについて説明しました。

プロトコル

現在のプロトコルは、ヴェローナ大学の倫理委員会(承認プロトコル番号1538)によって承認され、それに従っています。インフォームドコンセントは、研究に参加している被験者から得られました。全血サンプルは、抗SARS-CoV-2ワクチンの接種過程にあった医療従事者(HCW)ボランティアから採取されました。これらのサンプルは、その後の血清¹⁵の単離のために抗凝固剤を含むプラスチックチューブに収集されました。

以下のすべてのプロセスは、クラス2の生物学的フードで実行し、無菌条件下で作業する必要があります。ウイルスの取り扱いは慎重に行う必要があり、すべての廃棄物は希釈された漂白剤溶液で中和する必要があります。プロトコルの概要を 図 1 に示します。

図1:中和アッセイのグラフ表示。 (A)PV生産、(B)PV滴定、および(C)中和アッセイ。すべての手順は、クラス2の生物学的フード内で無菌条件下で行われます。滴定ステップ(B)は、中和アッセイ(C)で使用する前にPVの感染レベルを標準化するために実行する必要があります。この図は BioRender で作成されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

1. SARS-CoV-2 PVの生産と感染力試験

1. 5 x 10⁵ HEK293T細胞を完全なダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、高グルコース、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を6ウェルプレート(6WP)に播種し、使用するトランスフェクション試薬に適合する適切な細胞密度に到達します。ポリエチレンイミン(PEI)を用いてトランスフェクションを行う場合(メーカーの指示に従って試薬を調製してください)、トランスフェクション当日に細胞が40〜60%の密度に達するようにします(ステップ1.3)。細胞を加湿したインキュベーターで37°C、5%_CO2で保管します。
2. トランスフェクションの前に、使用済み細胞培地を抗生物質を含まない新鮮な培地(DMEM、高グルコース、10%FBS、1%L-グルタミン)と交換して、トランスフェクション効率を高めます。
   注:播種の翌日には、HEK293T細胞をトランスフェクションする準備が整います。
3. 接着性HEK293T細胞を適切なトランスフェクション試薬でメーカーの指示に従ってトランスフェクションします。PEIを使用する場合は、2つのミックスを準備し、以下の手順に従います。
   1. ミックスAを調製するには、500 ngのpCMV-dR8.91パッケージングプラスミド¹⁶、750 ngのpCSFLWレポータープラスミド¹⁶、および450 ngのSARS-CoV-2スパイク発現プラスミドを100 μLの還元血清培地に添加します。
   2. ミックスBを調製するには、還元血清培地100 μLに17.5 μLのPEI(濃度:1 mg/mL)を加えます。
   3. 両方の混合物を室温(RT)で5分間インキュベートします。次に、PEIミックスBをDNAミックスAに加えて、両方のチューブの内容物を混合します。
   4. RTでチューブを20〜30分間インキュベートし、3〜4分ごとにチューブを軽くフリックして混合を促進します。最後に、混合物をHEK293Tセルに加えます。
4. トランスフェクションの16〜20時間後に、培地を新鮮で完全なDMEMと交換します。37°C、5%_CO2でインキュベートし、トランスフェクションした細胞によるPVの産生を可能にします。
5. トランスフェクションの72時間後に、PVを含む上清を回収します。次に、室温で1600 x g で7分間遠心分離し、細胞の破片と死細胞を除去し、0.45 μmの酢酸セルロースフィルターでろ過します。
6. オプションのステップ:PV力価の最終収率を上げるには、複数のトランスフェクションを実行し、PVを含む細胞培地をプールし、濃縮チューブを使用して濃縮します。
7. 次のステップ(「PV滴定」、セクション2)に直接進むか、PV含有培地を適切なチューブに分注し、使用するまで-80°Cで保存します。滴定に使用する追加のアリコート(400〜500μL)を準備します。
   注:複数のアリコートを作成することで、過度の融解凍結サイクルを回避し、実験間の再現性が保証されます。

2. PV滴定

1. 次のステップでは、新鮮なPV含有培地を使用するか、試験アリコートを解凍して(ステップ1.7)、新しいウイルスストックの滴定を行います。同じPVストックのアリコートを凍結することで、再現性が保証されます。
2. PVストックを二重に試験するために必要な96ウェルプレート(96WP)のすべてのウェルに、50 μLの完全DMEM(または使用中の標的細胞株に適合する完全培地)を添加し、行「A」を空のままにします。100 μL の PV ストックを列「A」に追加します。試験する調製物の数に基づいて、「細胞のみ」のコントロールとして、ウイルスを含まない列を 1 つ残します(図 2)。
3. A列からB列まで50 μLをピペットで移し、このプロセスを列Gまで繰り返して、初期ストックの段階希釈液を取得します。最後の行から余分なボリュームを廃棄します。
4. 使用済みの培地を除去し、DPBS 1xで細胞を2回洗浄した後、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水1x(DPBS 1x)中のトリプシン/エチレンジアミン四酢酸1x(EDTA)を使用して細胞を剥離します。4 x 10⁵ cells/mLの密度で細胞を調製します。
   注:このプロトコルでは、PVsの伝染は感受性細胞株HEK293T/ACE2でテストされた;このような細胞はHEK293Tに由来し、レンチウイルスベクターを用いて形質導入され、ACE2受容体を発現した。
5. 各ウェルに50 μLの細胞懸濁液を添加し、ウェルあたり2 x 10⁴ 細胞の細胞数を確保します。
6. 37°C、5%_CO2で48時間インキュベートします。
7. インキュベーション後、ルシフェラーゼアッセイを実施して、メーカーの指示に従って読み取り値を取得します。100 μLのルシフェラーゼ試薬をウェルに加え、室温で暗所で2分間インキュベートします。各ウェルの内容物を黒色の96ウェルプレート(利用可能なプレートリーダーと互換性あり)に移し、96ウェルプレートリーダーでプレートを読み取ります。
   注:ルシフェラーゼの読み出しに使用されるルミノメーターは、ダウンストリーム分析に使用される未処理の生データを含むスプレッドシートファイル(この場合はExcelファイル)を生成します。ウイルスの感染力は、相対発光単位(RLU)で表されます(パラグラフ4.1で説明)。

図2:PV滴定用の96ウェルプレートの代表的なレイアウト。 一定量のPV含有上清を列Aの列1〜11に添加し、段階希釈する。最後の列は "セルのみ" コントロールとして残されます。この図は BioRender で作成されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

3. 中和アッセイ

1. 氷上で患者の血清を解凍します。血清サンプルを56°Cで30分間インキュベートして不活化します。
2. 96ウェルプレートで、50 μLの新鮮で完全なDMEM(または使用した標的細胞株に適合する完全な培地)を、行B(列1〜10)から行H(列1〜10)のそれぞれに加えます。95 μLの新鮮で完全なDMEMを行A(列1〜10)に入れます。50 μL および 100 μL の完全 DMEM をカラム 11 および 12 のウェルにそれぞれ添加します。これらは、それぞれ感染したコントロール(ウイルスコントロール、VC)と感染していないコントロール(細胞のみ、CC)です(図3)。
3. 5 μLの熱不活化血清/血漿サンプルを列A(列1〜10)に追加します。各サンプルは重複します。マルチチャンネルピペットを使用して、最初の列のサンプルを混合し、血清を含む培地50 μLを列Aから列Bに移動します。 このプロセスを最後の列まで繰り返します(図3)。残りの50μLは廃棄します。
4. 必要な数のPVアリコートを解凍し、≥ 10⁴ RLU/mLに希釈します。マルチチャンネルピペットを使用して、50 μLの希釈PV含有培地を各ウェル(カラム1からカラム11まで)に添加し、ウイルスに対する熱不活化血清/血漿を1:1に希釈します。37°C、5%_CO2で1時間インキュベートし、血清サンプル中の抗体がPV上のSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合します。
5. 感受性細胞(HEK293T/ACE2)の懸濁液を、細胞密度4 x 10⁵ cells/mLで少なくとも5 mL調製します。各ウェルに50 μLの細胞懸濁液を加え、37°C、5% CO₂で48時間インキュベートします。
6. インキュベーション後、ステップ2.7で説明したように、メーカーの指示に従ってルシフェラーゼアッセイの読み取りを行います。
   注:ルシフェラーゼの読み出しに使用されるルミノメーターは、ダウンストリーム分析に使用される未処理の生データ(ルシフェラーゼアッセイファイル)を含むスプレッドシートファイル(この場合は.xlsx)を生成します。

図3:血清希釈率に基づくプレート表現。 明るい赤は血清量が多いこと、明るい青色のレーン(11列目)は感染細胞コントロール(VC、ウイルスコントロール)に対応します。水色のレーン(12列目)は、非感染細胞(CC、細胞コントロール)に対応します。この図は BioRender で作成されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

4. 滴定分析

1. ルシフェラーゼアッセイファイルで、対応するサンプルに名前/タイトルを割り当てます。
2. RLU 測定値に希釈係数 (グリッドの上から下へ: 20 倍、40 倍、80 倍、160 倍、320 倍、640 倍、1,280 倍、2,560 倍) を掛けて、RLU/mL を求めます。異なる希釈係数を使用する場合は、それに応じて乗算係数を変更します。
3. 各 PV 調製物の平均 RLU/mL を計算します。

5. PV中和アッセイ分析

1. ルシフェラーゼアッセイスプレッドシートファイル(この場合は.xlsx)で、テストしたサンプルに対応するタイトルを割り当てます。サンプルの希釈倍率(40秒、80倍、160倍、320倍、640倍、1,280倍、2,560倍、5,120倍)を入力します。希釈係数のLog10を計算します。
2. 非感染対照群と感染対照群の平均RLUを計算します(図3、それぞれ11列目と12列目)。これらの値は、手順 5.5 の正規化に役立ちます。
3. データ分析のために新しいドキュメントを開きます。 X/Y分析を選択し、 Xを数値 に、Yを 2つの反復値を並べてサブ列に入力します。
4. Log10 (希釈) 値を X 値として入力します。サンプルの重複する RLU を入力します。
5. [分析]>[正規化]に移動し>同じシート上のすべてのサンプルにフラグを付けます。VCとCCの平均値をそれぞれ[0%の定義方法]と[100%の定義方法]に入力します。[OK] をクリックします。
6. 正規化されたデータシートで、 XY解析>解析>非線形解析(カーブフィット)に進みます。すべてのサンプルにフラグを付け、[ OK]をクリックします。 用量反応 - 阻害に、 対数(阻害剤)対正規化反応 - 可変傾きを選択します。
7. [制限] で [HillSlope] を [Must be less than 0] に変更します。
8. [出力] で、フラグを立てます サマリー テーブルとグラフを作成します。[OK]をクリックして、最終解析を取得します。分析用のテンプレートを含む作業シートは、補足ファイル1で提供されています。

結果

このプロトコルでは、SARS-CoV-2 PVの産生と、抗COVID-19ワクチン接種を受けている被験者の血清/血漿の中和活性を分析するためのこれらのPVの下流アプリケーションについて説明します¹⁷。さらに、このプロトコルを適用して、懸念される各SARS-CoV-2変異株(VOC)の偽型を生成して、中和応答の進化をテストできます。このプロトコルは、COVID-19ワクチン接種後の液性免疫応答の研究...

ディスカッション

野生型ウイルスの使用は実際の感染をシミュレートしますが、レンチウイルスPVは、病原性ウイルスを扱うために必要な厳格な安全要件なしに、ウイルスの侵入と感染に関連するメカニズムを研究するためのより安全な選択肢です^4,20,21。PVは、複製欠損ウイルスコアと、本研究の目的である病原性ウイルスの表面エンベロ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	SARSTEDT	83 1826
6-well plate	SARSTEDT	83 3920
96-well plate	SARSTEDT	8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merck	10403892
Black Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium	SIGMA-ALDRICH	D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)	AUROGENE	AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum	AUROGENE	AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7	graphpad dotmatics	NA	In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine	AUROGENE	AU-X0550-100
Luminometer - Victor3	Perkin Elmer	HH35000500	In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer'
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium'
p8.91 packaging plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin	AUROGENE	AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)	SIGMA-ALDRICH	408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)	Addgene	145839	This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid	Addgene	pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6066759	In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x	AUROGENE	AU-L0949-100