中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

要約

偽型ウイルス(PV)は、複製欠損のあるウイルス粒子であり、本物のウイルスを扱うよりも安全な条件下で宿主とウイルスの相互作用を研究するために使用されます。ここでは、SARS-CoV-2 PVを使用して、COVID-19ワクチン接種後の患者の血清の中和能力をテストする方法を示す詳細なプロトコルを紹介します。

要約

シュードタイプウイルス(PV)は、宿主とウイルスの相互作用を研究し、血清サンプルの中和能力をテストするために使用できる分子ツールであり、目的遺伝子を送達するための遺伝子治療での使用がよく知られています。PVは、ウイルスゲノムがPVに取り込まれない異なるプラスミドに分割されているため、複製に欠陥があります。この安全で汎用性の高いシステムにより、バイオセーフティレベル2のラボでPVを使用できます。ここでは、ここで述べた3つのプラスミドに基づいてレンチウイルスPVを産生する一般的な方法論を提示します:(1)感染を監視するために必要なレポーター遺伝子を運ぶバックボーンプラスミド。(2)PVを生成するために必要なすべての構造タンパク質の遺伝子を運ぶパッケージングプラスミド。(3)ウイルスの向性を決定し、宿主細胞へのウイルスの侵入を媒介するエンベロープ表面の糖タンパク質発現プラスミド。この研究では、SARS-CoV-2スパイクは、非複製性SARS-CoV-2偽型レンチウイルスの産生に使用されるエンベロープ糖タンパク質です。

簡単に説明すると、パッケージング細胞(HEK293T)を標準的な方法を用いて3つの異なるプラスミドと同時トランスフェクションしました。48時間後、PVを含む上清を回収し、ろ過し、-80°Cで保存した。 SARS-CoV-2 PVの感染力は、感染後48時間後の標的細胞株におけるレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)の発現を調べることによってテストされました。相対発光単位(RLU)の値が高いほど、感染/形質導入率は高くなります。さらに、感染性PVを段階希釈した血清サンプルに添加して、偽ウイルスが標的細胞に侵入する中和プロセスを調べ、RLU強度の低下として測定しました。

概要

偽型ウイルス(PV)は、微生物学において宿主ウイルスおよび病原体と病原体の相互作用を研究するために使用される分子ツールです^1,2,3,4。PVは、ウイルスゲノムを保護するウイルスコアである内側の部分と、ウイルスの表面にあるエンベロープ糖タンパク質である外側の部分から構成され、屈性を規定しています⁵。偽ウイルスは、新しいウイルス粒子を生成するためのすべての遺伝情報を含んでいないため、標的細胞内で複製する能力がありません。この独特な特徴の組み合わせにより、PVは野生型ウイルスの安全な代替品となります。一方、野生型ウイルスは病原性が高く、BSL2の検査室^{では分析に}使用できない6。

PVの感染力は、通常、蛍光タンパク質(GFP、RFP、YFP)または化学発光産物を産生する酵素(ルシフェラーゼ)をコードするレポーター遺伝子によってモニターできます。これは、PV産生に用いられるプラスミドの1つに含まれ、偽ウイルス⁷のゲノムに組み込まれる。

プロトコル

現在のプロトコルは、ヴェローナ大学の倫理委員会(承認プロトコル番号1538)によって承認され、それに従っています。インフォームドコンセントは、研究に参加している被験者から得られました。全血サンプルは、抗SARS-CoV-2ワクチンの接種過程にあった医療従事者(HCW)ボランティアから採取されました。これらのサンプルは、その後の血清¹⁵の単離のために抗凝固剤を含むプラスチックチューブに収集されました。

以下のすべてのプロセスは、クラス2の生物学的フードで実行し、無菌条件下で作業する必要があります。ウイルスの取り扱いは慎重に行う必要があり、すべての廃棄物は希釈された漂白剤溶液で中和する必要があります。プロトコルの概要を 図 1 に示します。

図1:中和アッセイのグラフ表示。 (A....

結果

このプロトコルでは、SARS-CoV-2 PVの産生と、抗COVID-19ワクチン接種を受けている被験者の血清/血漿の中和活性を分析するためのこれらのPVの下流アプリケーションについて説明します¹⁷。さらに、このプロトコルを適用して、懸念される各SARS-CoV-2変異株(VOC)の偽型を生成して、中和応答の進化をテストできます。このプロトコルは、COVID-19ワクチン接種後の液性免疫応答の研究.......

ディスカッション

野生型ウイルスの使用は実際の感染をシミュレートしますが、レンチウイルスPVは、病原性ウイルスを扱うために必要な厳格な安全要件なしに、ウイルスの侵入と感染に関連するメカニズムを研究するためのより安全な選択肢です^4,20,21。PVは、複製欠損ウイルスコアと、本研究の目的である病原性ウイルスの表面エンベロ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	SARSTEDT	83 1826
6-well plate	SARSTEDT	83 3920
96-well plate	SARSTEDT	8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merck	10403892
Black Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium	SIGMA-ALDRICH	D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)	AUROGENE	AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum	AUROGENE	AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7	graphpad dotmatics	NA	In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine	AUROGENE	AU-X0550-100
Luminometer - Victor3	Perkin Elmer	HH35000500	In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer'
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium'
p8.91 packaging plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin	AUROGENE	AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)	SIGMA-ALDRICH	408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)	Addgene	145839	This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid	Addgene	pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6066759	In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x	AUROGENE	AU-L0949-100