EV活性化凝固時間(EV-ACT)を用いた細胞外小胞(EV)の凝固促進活性の決定

要約

このプロトコルは、EVの凝固能力の指標として細胞外小胞(EV)が豊富な血漿の使用を調査します。EVに富む血漿は、差動遠心分離とその後の再石灰化のプロセスによって得られます。

要約

さまざまな疾患における細胞外小胞(EV)の役割は、特に強力な凝固促進活性により、ますます注目を集めています。しかし、臨床現場でのEVの凝固促進活性を評価するためのベッドサイドテストが緊急に必要とされています。この研究は、EVの凝固促進活性の尺度として、EVリッチ血漿のトロンビン活性化時間の使用を提案しています。標準化された手順を使用してナトリウムクエン酸全血を採取し、続いて差動遠心分離を行ってEVに富む血漿を得ました。EVリッチ血漿と塩化カルシウムをテストカップに加え、分析装置を使用して粘弾性の変化をリアルタイムで監視しました。EV-ACTと呼ばれるEVリッチプラズマの自然凝固時間を決定しました。その結果、健康なボランティアから得られた血漿からEVを除去するとEV-ACTが有意に増加し、EVを濃縮すると有意に減少することが明らかになりました。さらに、子癇前症、大腿骨頸部骨折、肺がんのヒト検体ではEV-ACTが有意に短縮され、血漿EV濃度の上昇と血液凝固亢進の促進が示された。EV-ACTは、その簡単で迅速な手順により、血漿EVレベルが高い患者の凝固機能を評価するためのベッドサイドテストとして有望です。

概要

凝固亢進によって引き起こされる血栓症は、脳外傷^1、子癇前症²、腫瘍³、骨折患者⁴など、さまざまな疾患で重要な役割を果たしています。凝固亢進のメカニズムは複雑であり、近年、凝固障害における細胞外小胞(EV)の役割が注目されています。EVは、直径10nmから1000nmの範囲で、細胞膜から剥離する二重層構造を持つ小胞状の物体です。それらはさまざまな疾患プロセス、特に凝固障害に関連して^{います5。}いくつかの研究により、EVが血栓症リスクの有望な予測因子であることが確認され^{ています6,7}。EVの凝固促進活性は、凝固因子、主に組織因子(TF)とホスファチジルセリン(PS)の発現に依存します。強力な凝固促進活性を持つEVは、テナーゼとプロトロンビン複合体の触媒効率を大幅に高め、それによってトロンビン媒介性フィブリノーゲンと局所血栓症を促進します⁸。EVのレベルの上昇と凝固亢進との因果関係は、多くの疾患で観察されています⁹。したがって、EVの検出を標準化し、その凝固促進活性を報告することは、重要な調査....

プロトコル

ヒト検体の収集は、天津医科大学総合病院の医療倫理委員会によって承認されました。ヒト静脈血の採取は、中国国家衛生健康委員会が発行したガイドライン、すなわちWS / T 661-2020静脈血検体の収集に関するガイドラインに厳密に従いました。簡単に説明すると、前上腕静脈からインフォームドコンセントを得て健康な人から血液を採取し、サンプルを3.2%クエン酸ナトリウム抗凝固剤を使用して1:9の比率で混合しました。クエン酸ナトリウム抗凝固剤検体のみを採取した場合、最初の採取容器は廃棄した。処理フローは、サンプル採取から 0.5 時間以内に開始されました。成人の健康な被験者は、インフォームドコンセントを得た後、サンプル収集のために募集されました。患者の除外基準は、(1)最近の血管内血栓症、(2)肝および腎機能障害、(3)高血圧、高脂血症、糖尿病、およびその他の慢性疾患、(4)アスピリンまたは抗凝固剤治療、(5)月経および妊娠でした。.

1. EVリッチプラズマの分離

1. サンプルを室温で120 x g で20分間遠心分離し、血球を除去します。上清は多血小板血漿です。次に、上清の上部1/2をピペットで新しい遠心チューブに移します。
2. 多血小板血漿を室温で1500 x g で20分間遠心分離し、血小板を除去します。上清は血小板に乏しい血漿です。次に、上清の上部1/2を新しい遠心チューブに移....

ディスカッション

本研究では、EVリッチ血漿の調製について記述し、フローサイトメトリーを用いてその方法の合理性を検証した。続いて、再石灰化した血漿試料を、粘弾性原理²⁴に基づく血栓分析装置を用いてACT時間で分析した。図3Aに示すように、超遠心分離で得られたEVの濃度はEV-ACT時間を短縮する一方で、EVレベルを低下させた超遠心分離後の上清はEV-ACT時間を長.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.