ショウ ジョウバエのmelanogaster PINK1B9-Null変異体のミトコンドリア機能の解析(高分解能スピロメトリー)

要約

ここでは、PINK1^B9欠損変異ショウジョウバエの生体エネルギーを解析するための高分解能肺活量測定プロトコルを紹介します。この分析法では、基質-アンカプラー-阻害剤-滴定(SUIT)プロトコルを使用します。

要約

パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患や、がんなどの細胞障害は、ミトコンドリア機能の障害を伴うエネルギー代謝を乱す疾患の一部です。ミトコンドリアは、エネルギー代謝と細胞の生存と死に関与する細胞プロセスの両方を制御する細胞小器官です。このため、ミトコンドリア機能を評価するアプローチは、病理学的および生理学的プロセスにおける細胞の状態に関する重要な洞察を提供することができます。この点で、高分解能スピロメトリー(HRR)プロトコルは、ミトコンドリア呼吸鎖機能全体または特定のミトコンドリア複合体の活性の評価を可能にする。さらに、ミトコンドリア生理学と生体エネルギー学の研究には、 ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のような遺伝的および実験的に扱いやすいモデルが必要です。

このモデルには、人間の生理学との類似性、迅速なライフサイクル、メンテナンスの容易さ、費用対効果、高いスループット能力、倫理的懸念の数の最小化など、いくつかの利点があります。これらの特性は、複雑な細胞プロセスを解剖するための非常に貴重なツールとしてそれを総合的に確立します。本研究では、ショウ ジョウバエ(Drosophila melanogaster )PINK1^B9欠損変異体を用いたミトコンドリア機能の解析方法について説明する。 pink1 遺伝子は、ミトコンドリアネットワークから機能不全のミトコンドリアを除去するために重要なマイトファジーとして認識されるプロセスを通じて、PTEN誘導推定キナーゼ1をコードする役割を担っています。この遺伝子の変異は、PDの常染色体劣性早期発症家族性型と関連している。このモデルは、PDの病態生理学に関与するミトコンドリア機能障害を研究するために使用できます。

概要

ミトコンドリアは、アポトーシス調節、カルシウム恒常性、生合成経路への参加などの重要な機能を制御する細胞小器官です。自律的な遺伝物質を持つことで、細胞の維持や修復プロセスに貢献することができます。その構造には、細胞エネルギーに不可欠な電子伝達鎖と酸化的リン酸化が収められています^1,2,3。特に、酸化的リン酸化(OXPHOS)^によるアデノシン三リン酸(ATP)の生成により、エネルギー制御が実現しています2。ミトコンドリア機能の障害を伴うエネルギー代謝の乱れは、細胞の生存^{と死の両方で}起こり^4,5、癌などの幅広いヒト病状やパーキンソン病(^PD)などの神経変性疾患にしばしば関連しています^3,6。

パーキンソン病は、慢性、進行性、神経障害です。この病気の主な原因は、脳細胞、特に運動を制御する神経伝達物質ドーパミンの産生に関与する黒質の死です

プロトコル

ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(ID番号:34749)の^w1118(白)およびw[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3(Pink1^B9と呼ぶ)(FlyBase ID:FBgn0029891)を用いた。本研究では、雄のD. melanogaster PINK1^B9欠損変異体を、対照群(遺伝的背景)として用いたw¹¹¹⁸株の雄のD. melanogasterと比較した。胸部の変形や移動障害など、ハエが正しい遺伝子型(Pink1^B9/Y)を持っていることを確認するために、他のパラメータは、Pink1^B9変異ハエ^24,25,26でよく説明されています。

1.動物と住居

1. ハエを10 mLの標準食(酵母1.73%、大豆粉0.9%、トウモロコシ粉7.3%、寒天0.5%、コーンシロップ7.6%、プロピオン酸0.48%)を含むガラス瓶に入れ、恒温恒湿(それぞれ25°Cおよび60%)....

結果

ここで、PINK1^B9 ヌルハエでは、OXPHOS CI(P = 0.0341)およびOXPHOS CI&II(P = 0.0392)状態の_O2フラックスが減少する(図4)。この結果は、私たちのグループ^29,30からの以前の調査結果でも観察されました。

CIとCIIは電子伝達系(ETS)の主要コンポーネントであり、CIはNADHからユビキノンへ?.......

ディスカッション

HRRは、 D. melanogaster やその他の生物のミトコンドリア呼吸とエネルギー代謝を研究するための強力な技術です。ミトコンドリア機能を詳細かつ定量的に評価し、研究者が細胞の生体エネルギー学に関する洞察を得ることを可能にします。ここに示されるプロトコルはD .のmelanogasterのスーツのプロトコルを使用してミトコンドリアの呼吸鎖機能そして特定のミトコンドリア複合体?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma-Aldrich	A5285	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar	Kasv	K25-1800	For bacteriologal use
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20700	Software for data acquisition and analysis
Digitonin	Sigma-Aldrich	D 5628	CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3			Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118			Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA	Sigma-Aldrich	E8145	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920	Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder
GraphPad Prism version 8.0.1.			Software for data acquisition and analysis
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	10022-02	Startup O2K respirometer kit
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH	Sigma-Aldrich	211473	Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate	Sigma-Aldrich	M1296	Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid	Sigma-Aldrich	M1000	(S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES	Sigma-Aldrich	M3671	2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes	Eppendorf
O2K-Titration Set	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20820-03	Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O 4876	Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate	Sigma-Aldrich	S 2378	Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	CAS number 107-35-7