偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析

要約

この論文では、偏光感受性2光子顕微鏡を使用して、ラベルフリーアミロイド上部構造-球晶体内の局所組織を特徴付ける方法について説明します。また、サンプルの調製と測定、必要なセットアップの組み立て、およびアミロイド線維の局所組織に関する情報を取得するためのデータの分析方法についても説明します。

要約

2光子励起は、1光子励起と比較して、光毒性が低く、組織への浸透が深く、高密度で密集したシステムでの効率的な操作が可能で、蛍光色素の光選択角度が小さくなるため、バイオイメージング実験に有益です。したがって、2光子蛍光顕微鏡(2PFM)における偏光分析の導入により、線形光学プロセスに基づく標準的なイメージング法と比較して、サンプル中の分子組織をより正確に決定することができます。本研究では、分極感受性2PFM(ps-2PFM)と、複雑な生体構造であるアミロイド球状突起内の分子秩序の決定への応用に焦点を当てています。アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患は、タンパク質のミスフォールディングプロセスの障害によって形成されるアミロイドタンパク質凝集体を検出することで診断されることがよくあります。その構造を探ることは、その生成経路をよりよく理解し、その結果、より感度の高い診断方法の開発につながります。本論文では、ウシインスリン球状物質および球状アミロイド原性タンパク質凝集体内の局所線維秩序の決定に適応したps-2PFMについて紹介する。さらに、提案手法により、球晶石内部のフィブリルの三次元組織化を解像できることを証明した。

概要

過去数十年にわたり、タンパク質とその凝集体のバイオイメージングのための多数の蛍光顕微鏡技術が大幅に開発されてきましたが^{1、サンプル内の}局所的な秩序を解明するために使用されたのはごくわずかです^2,3。蛍光寿命イメージング顕微鏡⁴は、アミロイド上部構造-球晶石の本質的な構造不均一性を研究するために使用されました。さらに、球晶石のような複雑で高密度に充填された生体構造内の局所秩序の定量的決定は、分極に敏感な方法を使用して解決することができました³。しかし、UV-VIS波長を使用してin vivoで蛍光色素を励起すると、組織の光散乱が大きくなるため、表在組織浸透を伴う標準的な蛍光技術には限界^{があります5。}さらに、このようなイメージングでは、特定の蛍光プローブを設計し、標的とする生体分子に結合する必要があることが多く、イメージングを行うために必要なコストと作業量が増加します。

最近、これらの問題に対処するために、私たちのチームは、偏光感受性二光子励起蛍光顕微鏡(ps-2PFM)を適応させ、生体構造のラベルフリーイメージングに用いることにした

プロトコル

1. 完全に成長した球状石を用いた顕微鏡スライドの準備

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。すべての溶液は、浄水システムから得られた脱イオン水(25°Cで18.2MΩ・cm)で調製しました。

1. 以下に説明するように、Krebsら¹⁶. によって記述されたプロトコルに基づいてアミロイドスフェルライトをインキュベートします。
   1. 1.5 mLチューブに10 mgのインスリン粉末を秤量します。
   2. 粉末を脱イオンH₂O/HCl溶液(pH 1.5)の1 mLアリコートで溶解します。
   3. サンプルをテープで密封し、サーマルミキサーに入れて70°C(0rpm)で24時間インキュベートします。
      注:アミロイドの天然(水和)環境でイメージングを行い、脱水によるサンプルの変形を防ぐには、以下の説明に従って顕微鏡スライドを準備する必要があります( 図2に示すスキーム)。
2. 顕微鏡スライドガラスを水でよく洗います。
3. スライドをメタノールに浸し、ほこりのないワイプで常温条件下で乾燥させま....

ディスカッション

偏光感受性2光子顕微鏡は、アミロイド上部構造内のフィブリルの局所的な秩序を研究するための貴重なツールであり、標準的な多光子セットアップを少し変更するだけで済みます。非線形光学現象を操作するため、1光子励起蛍光顕微鏡法と比較して、角度による光選択の低減と軸方向分解能の向上を達成できます。さらに、1光子励起蛍光顕微鏡技術と比較して、光散乱が少なく、光毒性が?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5