人工多能性幹細胞からの懸濁液中の腎臓オルガノイドの生成

要約

このプロトコルは懸濁液培養条件を使用して誘導された多能性幹細胞(iPS細胞)から腎臓オルガノイドを生産するための包括的で効率的な方法を提示します。この研究の主な重点は、初期細胞密度とWNTアゴニスト濃度の決定にあり、それによって腎臓オルガノイド研究に関心のある研究者に利益をもたらします。

要約

腎臓オルガノイドは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からさまざまなアプローチで作製することができます。これらのオルガノイドは、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および潜在的な治療用途に大きな期待が寄せられています。本稿では、iPS細胞から腎臓オルガノイドを作製する手順を、後原始線条(PS)から中間中胚葉(IM)まで順を追って説明します。このアプローチは、動物成分を含まない定義された培地であるAPEL 2培地に依存しています。高濃度のWNTアゴニスト(CHIR99021)を4日間補給し、続いて線維芽細胞成長因子9(FGF9)/ヘパリンと低濃度のCHIR99021をさらに3日間補給します。このプロセスでは、iPS細胞の開始時に最適な細胞密度とCHIR99021濃度を選択することに重点が置かれます。このプロトコルの重要な面は、IMが徐々にネフロン構造に発展し、糸球体、近位管状、および遠位管状構造を網羅し、すべて視覚的に理解可能な形式で提示されるようにする、低接着プレートでの懸濁培養です。全体として、この詳細なプロトコールは、多様なiPS細胞から腎臓オルガノイドを作製するための効率的で特異的な技術を提供し、成功し、一貫した結果を保証します。

概要

腎臓は、その機能単位に応じて、生理学的恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。老廃物を排泄するネフロンは、体液の組成を調節することができます。遺伝性突然変異などの高リスク因子によって引き起こされる慢性腎臓病(CKD)は、最終的には末期腎臓病(ESKD)に進行します^1,2。ESKDは、ネフロンの再生能力が限られていることが原因と思われます。したがって、腎代替療法が必要です。ヒトiPS細胞の分化を指示することで、患者特異的な3D腎臓オルガノイドをin vitroで作製することができ、腎臓の発生の研究、患者固有の疾患のモデル化、腎毒性薬物スクリーニングの実施に使用できます^3,4。

胚発生中、腎臓は中間中胚葉(IM)に由来し、原始線条(PS)と区別されます。古典的なWNTシグナル伝達経路は、FGF(FGF9、FGF20)とBMP(JNKを介したBmp7シグナル^伝達)の協調的な関与により、IMのさらなる分化を誘導する可能性があります5,6,7。それ....

プロトコル

本研究に用いたiPS細胞は、市販のものを入手したものである。細胞は、市販の基底膜マトリックスコーティングプレート上でmTeSR培地で維持しました( 材料表を参照)。 表1 には、研究で利用されたすべての培地組成が含まれています。

1. iPS細胞の分化と後原始線条(PS)誘導のためのプレーティング

1. メンブレンマトリックスでコーティングされた6ウェルプレート上のiPS細胞を2 mLのDPBSで洗浄します。ピペットを使用してDPBSを吸引します。
2. 市販の細胞剥離液( 材料表参照)を1 mL添加してiPS細胞を剥離し、37°Cで5分間インキュベートします。
3. iPS細胞にmTeSRを1 mL添加し、細胞がプラスチック表面から浮き上がっていることを確認します。
4. 細胞を室温(RT)で400 x g で3分間遠心分離します。細胞ペレットを再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。
5. メンブレンマトリックスでコーティングした24ウェルまたは6ウェルプレートにさまざまな細胞密度を播種し、10 μMのRhoキナーゼ阻害剤(Y-27632)を添加したmTeSRで培養します( 材料表を参照)。37°Cの

ディスカッション

iPS細胞から腎臓オルガノイドを作製するための詳細なプロトコルが記載されており、基礎培地、初期細胞密度、およびCHIR99021濃度にわずかな変更を加えます。さまざまな実験において、腎臓オルガノイドの作製を成功させるための重要な要素は、中間中胚葉(IM)の初期分化と7日目の細胞状態であることがわかりました。さらに、iPS細胞株が異なれば、細胞増殖能や分化能にもばらつきがあり?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304