マウス精巣上体脂肪組織からの間葉系幹細胞の単離、In vitro拡大、および特性評価

要約

脂肪組織は、間葉系幹細胞の優れた供給源です。ここでは、スイスのマウス精巣上体脂肪組織からの脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の段階的な抽出、培養、および特性評価をもたらします。

要約

間葉系幹細胞(MSC)は、免疫応答を調節する可能性があるため、主に炎症の悪化を止めるための新しい治療アプローチとして広く研究されてきました。MSCは、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の低発現に基づく免疫学的に不適合な同種移植レシピエントで生存し、同種移植のための細胞ベースの治療の使用において生存できる免疫特権細胞です。これらの細胞はいくつかの組織から単離することができ、最も一般的に使用されるのは骨髄および脂肪組織です。私たちは、マウスの精巣上体脂肪組織からMSCを分離、培養、および特性評価するための簡単なプロトコルを提供します。精巣上体脂肪組織を外科的に切除し、物理的に断片化し、0.15%コラゲナーゼII型溶液で消化します。次に、初代脂肪組織由来幹(ADSC)細胞を in vitroで培養および増殖させ、フローサイトメトリーによって表現型の特性評価を行います。また、ADSCを骨形成細胞、脂肪形成細胞、軟骨形成細胞に分化するための手順と、それに続く各細胞系統の機能的特性評価についても説明します。ここで提供されるプロトコルは、 in vivo および ex vivo 実験に使用でき、代替として、脂肪由来幹細胞を使用してMSC様不死化細胞を生成することができます。

概要

間葉系幹細胞(MSC)は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞^1,2などの細胞に分化する成体の多電位細胞です。これらの細胞はいくつかの臓器に存在し、そのため、骨髄、筋肉、脂肪、毛包、歯根、胎盤、真皮、軟骨膜、臍帯、肺、肝臓、脾臓などの成体組織から抽出することができます^3,4。

MSCが生理機能と免疫系に及ぼす影響が報告されています^5,6。これらの細胞は、ヒト医学と獣医学の両方で、いくつかの疾患の治療に有望です。MSCは、細胞間接触、可溶性因子、および小さな細胞外小胞7,8,9,10などのさまざまなメカニズムを通じて、炎症を制御し、血管新生および組織の恒常性を促進することができる。さらに、MSCは、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の発現が低く、同種移植の細胞ベースの治療に使用されるため、免疫学的に不適合な同種移植レシピエントで生存できる免疫特権細胞です^11,12。低免疫原性と再生能が組み合わさったMSCは、移植片対宿主病(GvHD)¹³、全身性エリテマトーデス(SLE)¹⁴、多発性硬化症¹⁵などの細胞治療に理想的な候補となっています^16,17。

MSCはいくつかの成体組織に存在するという事実にもかかわらず、脂肪組織は、最小限の外科的介入で、収穫のためのアクセシビリティなど、他の供給源よりも優れています。高い拡張率で利用可能な多数のセル。また、特定の機器や低コストの材料を必要とせずに、簡単に実行できるプロトコルを使用して、in vitroでの展開が容易になります18,19,20。抽出された脂肪組織由来幹細胞(ADSC)は、国際細胞療法学会(ISCT)²¹によって確立されたように特徴付けられなければならない。したがって、MSCは、形態が線維芽細胞様で、可塑性培養に付着し、エンドグリン(CD105)、ecto-5'-ヌクレオチダーゼ(CD73)、Thy-1(CD90)などの間葉系マーカーを高い割合(≥95%)で発現し、白血球共通抗原(CD45)、膜貫通リン糖タンパク質(CD34)、糖脂質固定膜糖タンパク質(CD14)、インテグリンα M(CD11b)、B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖(CD79α)などの造血マーカーの割合が低い(≤2%)を示さなければなりません。Bリンパ球表面抗原B4(CD19)およびクラスIIヒト白血球抗原(HLA-II)。さらに、機能的な特性評価が必要であり、細胞は骨芽細胞、軟骨芽細胞、または脂肪芽細胞に分化できるべきである²¹。

ここでは、 in vitro 研究のための機械的解離と酵素消化、およびISCTによって予め設定された形態学的特性評価を使用して、精巣上体脂肪組織からMSCを取得する方法を示します。

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プロトコル

すべての動物実験は、動物倫理に関する国際的なガイドラインに従って実施され、サンタクルーズ州立大学の機関のケアおよび使用委員会によってプロトコル番号021/22で承認されました。スイスの雄マウス(6〜8週間)は、サンタクルス州立大学動物研究施設(LaBIO-UESC)の動物研究施設から入手し、特定の病原体のない条件で維持され、12時間の明暗サイクルで水と食物を自由に受け取りました。

注:他のマウス系統を使用できます。成体マウス(6-8週)は、脂肪組織や細胞が発達し、増殖活性が高いため、使用をお勧めします。

1. 事前準備

注:先に進む前に、以下に説明する以下の試薬を準備してください。試薬および材料供給業者の情報については、 材料表 を参照してください。マスク、キャップ、白衣、手袋などの個人用保護具は、すべての実用的な手順で着用する必要があります。

1. 精巣上体脂肪組織抽出
   1. 手術材料を予約します:滅菌ピンセットとハサミ3セット、針5本、70%エタノール200mLを含むビーカー。
   2. ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)を混合して、終末麻酔薬を準備します。
2. ADSCの文化
   1. 基礎培地:10%ウシ胎児血清(FBS)、50 μg/mLゲンタマイシン、0.25 μg/mLアムホテリシンB、100 U/mLペニシリン、および100 mg/mLストレプトマイシンを添加したダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)高グルコース培地を調製します。
   2. 消化液:0.25 μmフィルターで滅菌したPBS中の0.15%のコラゲナーゼII型を調製します。
      注:基礎培地に記載されている4つの抗生物質を使用する必要はありません。これは、これが行われる研究室の細胞培養条件によって異なります。
3. ADSCの表現型の特徴付け
   1. PBSで1%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製します。
   2. 表1に記載されているように抗マウス抗体を希釈します。
   3. PBSで2%ホルムアルデヒドを調製します。
4. ADSCの骨形成分化
   1. 骨分化培地:5.67 Mアスコルビン酸、10 nMデキサメタゾン、0.02 M β-グリセロリン酸、10%FBS、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMを調製します。
   2. フォンコッサ染色では、70%エタノール水溶液、5%硝酸銀水溶液、蒸留水、5%チオ硫酸ナトリウム水溶液、1%エオシンB水溶液を調製します。
5. 脂肪原性分化:
   1. 脂肪分化培地:0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、200 μMインドメタシン、1 μMデキサメタゾン、10 μMインスリン、10% FBS、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMを調製します。
   2. オイルレッド染色には、次の溶液を準備します:脱イオン水中の10%ホルマリン、脱イオン水中の60%イソプロパノール、60%イソプロパノール中のリソクロム(脂溶性染料)ジアゾ染料(オイルレッドO溶液)、および脱イオン水中の1%ヘマトキシリン。
6. 軟骨原性分化:
   1. 軟骨原性分化培地:10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補給した軟骨原性培地を調製します。
   2. PBSで10%ホルムアルデヒドを調製します。
   3. プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン染色には、酢酸、pH 2.5、パラフィン、ヘマトキシリン、エタノール系列水希釈(100%、96%、80%、70%)のヘテログリカン染色液(Alcian Blue 1%)を調製します。

抗体/蛍光色素	希釈	クローン	最終濃度(μg/mL)	それが発現する機能と細胞
CD34-PEの	1:100	RAM34の	2	細胞接着因子。造血幹細胞。
CD45- APCの	1:100	30-F11	2	白血球の活性化の補助。白血球で発現します。
CD71-フィット	1:100	C2	5	細胞増殖中の鉄の取り込みを制御します。増殖細胞、網状赤血球、および前駆細胞。
CD29-フィット	1:100	HA2/5	5	接着と活性化、胚形成、白血球、樹状細胞、血小板、肥満細胞、線維芽細胞、および内皮細胞。
CD90 - パーCP	1:100	OX-7	2	シグナリング、接着。Tリンパ球、NK、単球、造血幹細胞、ニューロン、および線維芽細胞。

表1:フローサイトメーターによるADSCの表現型特性評価に用いた抗体。 抗体のリストと、それぞれの蛍光色素、希釈液、クローン、最終濃度、および発現する細胞内での機能。

2. メソッド

注:脂肪組織は、全身の皮下または腹腔内の位置に分布しています。マウスでは、実験に使用される最も一般的な脂肪組織には、皮下精巣上体、間膜、および後腹膜^{組織が含まれます22}。ここでは、精巣上体脂肪組織を採取する手順を示します(図1)。

図1:スイスのマウスから脂肪組織由来幹細胞を得るための実験デザイン (A)針を使用して、動物をコルクまたは発泡スチロールボードの上に置きます。(B)ピンセットを使用して皮膚を持ち上げ、腹部の中央に切り込みを入れ、皮膚を腹膜から剥がします。(C)精巣上体の上の白色脂肪組織を特定する;(d)組織を10%FBSおよび1%抗生物質を補充したDMEM培地に移し、精巣上体脂肪組織をPBSで完全に洗浄し、組織を消化液に移す;(E)、組織を断片化し、(F)37°Cで1時間インキュベートし、10分ごとに激しく振とうします。(G)細胞をカウントした後、6ウェルプレートにプレートし、倒立顕微鏡で細胞の形態を観察します。(F)細胞の形態は丸いものから線維芽細胞様に変化します。スケールバー = 22.22 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 精巣上体脂肪組織の抽出
   注:純粋で汚染のない細胞培養を確保するために、すべての手順は層流キャビネット内の無菌条件下で実施する必要があることに注意してください。
   1. ケタミンとキシラジン溶液(ステップ1.1.2で説明したように100および10 mg / kg)を使用して、腹腔内経路で動物を安楽死させます。
      注:他の安楽死方法を使用することができる²³。心拍がないことを確認して、動物が死んでいることを確認してください。
   2. 動物を腹側を上にして、アルミホイルで覆われたコルクまたは発泡スチロールボードに置き、滅菌針を使用して固定します(図1A)。
      注意: 汚染を避けるために、腹部に70%アルコールをスプレーします。または、メスで髪を剃ります。
   3. 腹部の中央にあるピンセットを使用して皮膚を持ち上げ、滅菌ハサミで切り込みを入れます。
      注:汚染を避けるために、滅菌ピンセットとハサミの2セットが必要です。最初のものは、動物を開くために使用され、皮膚と腹膜層を切断します。2つ目は、精巣上体脂肪組織を拾うために使用されます。また、ビーカーに70%アルコール150mLを備蓄して、ステップの合間にハサミやピンセットを掃除します。
   4. はさみを動物の皮膚の下に導入し、開いて腹膜からはさみます(図1B)。ピンセットを使用して腹膜層を持ち上げ、滅菌ハサミで切断します。
   5. 滅菌ピンセットとハサミの別のセットを使用して、精巣の上の精巣上体と精巣上体の上の白い脂肪組織を特定します。約2 cmサイズの滅菌ピンセットを使用して精巣上体脂肪組織全体を引っ張り、精巣上体のすぐ近くで切断します(図1C)。
   6. 基礎培地が入った50mLの滅菌円錐管に脂肪を入れ、氷の上に置きます(図1D)。ボンネット内で、以下で説明するように次の手順に進みます。
2. 脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の単離
   注:サンプルは生物学的クラスII層流フードで処理し、人員は白衣、手袋、サージカルマスクを着用する必要があります。
   1. 精巣上体脂肪組織をPBSでよく洗います。
      注:この手順は、サンプルから血液やその他の粒子を除去するために不可欠です。血液はコラゲナーゼII型酵素を阻害し、実験を損なう可能性があります。
   2. 滅菌ピンセットを使用して、精巣上体脂肪組織を、ステップ1.2.2として調製した消化液15〜20mLの入った50mLチューブに移します。滅菌ハサミを使用して組織を断片化し、組織を37°Cで1時間インキュベートします(図1E、F)。
      注:このステップでは、37°Cのウォーターバスまたはインキュベーターを使用できます。10分ごとに、消化を促進するために懸濁液を激しく振る必要があります。1時間のインキュベーション時間を延長しないでください。
   3. サンプルを基礎培地で1:1に希釈してコラゲナーゼを不活性化し、懸濁液を250 x g で4°Cで10分間遠心分離して、間質の血管分画を取得します。上清を捨て、ペレットを1mLの基礎培地に再懸濁します。
   4. 生存率を確認し、ノイバウアーチャンバー内のトリパンブルー色素排除法で1:10または1:100の希釈を使用して細胞をカウントします。
      注:予想される収率は、約50万〜100万細胞/gの加工脂肪組織と80%の生存率です。
   5. 単離された細胞(0.3〜50万)を3mLの基礎培地に6ウェルプレートの1ウェルでプレート化します。細胞を37°Cで一晩インキュベートし、5 % CO₂でインキュベートします。
   6. 翌日:培地をウェルから取り出し、PBSで細胞を洗浄します。3mLの基礎培地を加えます。このプロセスを2日ごとに繰り返し、細胞が90%コンフルエントになるまで繰り返します。
      注:常に倒立顕微鏡下で細胞の形態を観察し、丸いものから線維芽細胞状に変化します(図1H)。
3. 脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の増殖
   注:細胞が~90%コンフルエントに成長したら、以下に説明するように継代培養に進みます。
   1. 培地をウェルから取り出し、細胞をPBSで洗浄します。0.5 mL/ウェルのトリプシン/EDTA(0.05 % トリプシン、200 mg/L EDTA)を添加し、プレートを37°Cで3〜5分間インキュベートして細胞を剥離します。
      注意: トリプシン/ EDTAで5分を超えないようにしてください。細胞の完全な剥離は、倒立顕微鏡下で確認する必要があります。このプロセスは、慎重にピペッティングしたり、プレートの側面を軽くたたいたりすることで加速できます。
   2. 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%抗生物質を添加したDMEMでサンプルを1:1に希釈して、酵素を不活性化します。
   3. 細胞懸濁液を2つのウェルに分割し、3 mLの基礎培地(DMEMに10%FBSと1%抗生物質を添加)を加えます。5% CO₂ で 37 °C で一晩インキュベートします。
   4. 翌日に媒体を変更し、その後 2 日ごとに 90% の合流点まで変更します。
   5. このプロセスを3回目まで繰り返し、表現型と機能特性評価に進みます。
      注:常に倒立顕微鏡下で細胞の形態を観察し、丸いものから線維芽細胞状に変化します。
4. 脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の特性評価
   1. フローサイトメトリーによる表現型の特徴付け
      1. ステップ2.3.1から2.3.2で説明されているように、トリプシン/ EDTAを使用して細胞を切り離します。
      2. 細胞をコニカルチューブ(50 mL)に集め、250 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を捨て、ペレットを1mLのPBSに再懸濁します。
      3. ステップ2.2.4で説明したように細胞をカウントし、96ウェルプレートのPBS100μLに0.5-1 x 10⁶ 細胞を播種します。
         注:ウェルの数は、蛍光色素コンジュゲートの色とサイトメーターのフィルター/レーザーによって異なります。
      4. PBS中の1% BSAで希釈した抗体(表1)を添加します。
         注:抗体を希釈するためにすでにBSAを使用しているため、非特異的結合を避けるためにFcブロックを使用する必要はありません。抗体を受け取らずに細胞のサンプルを予約し、染色のコントロールとして使用します。抗体は、ラボで利用可能な蛍光色素とサイトメーターに従って、同じウェルで組み合わせることができます。 表1 に記載されているすべての抗体は、CD71 FITCおよびCD29 FITCを除き、同じウェルに添加することができます。ただし、CD71 FITCおよびCD29 FITCは、同じ蛍光色素であるため、異なるウェル内に存在しなければなりません。
      5. プレートを暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
      6. 細胞を洗浄し、PBSを使用して容量を200 μLまで完成させ、プレートを252 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てます。この手順をもう一度繰り返します。
      7. PBS中の2%ホルムアルデヒドをウェルあたり200μL添加して細胞を固定します。細胞を4°Cの暗所で保存し、フローサイトメーターで解析します。
         注:最良の結果を得るには、できるだけ早くフローサイトメーターで細胞を採取してください。マーカーの蛍光の明るさは、ほとんどの蛍光色素で48時間後に大幅に減衰します。したがって、プレートを読み取るために48時間を超えないようにしてください。30,000件のイベントを獲得することをお勧めします。
      8. 図 2B に示されているゲーティング戦略を使用して、ASC 母集団を選択します。
   2. 機能特性評価:骨形成分化
      1. トリプシン/EDTAを使用して細胞を分離し(ステップ2.3.1から2.3.2を参照)、細胞を収集および遠心分離し(ステップ2.4.1.2および2.4.1.2を参照)、カウントします(ステップ2.2.4を参照)。
      2. プレート、三重、基礎内側の6ウェルプレートにウェルあたり2 x 10⁵ 細胞(DMEMに10%FBSおよび1%抗生物質を補充);37°Cで5%CO₂中でインキュベートします。
         注:分化時間(14日と21日)ごとに1つずつ、合計2枚の6ウェルプレートが必要です。
      3. 翌日、培地を骨形成培地に変更します(ステップ1.4.1)。
         注:予備の3つのウェルは、分化のためのコントロールとなる基礎培地のみで培養されます。
      4. 骨形成培地とコントロール細胞で細胞を14日間および21日間培養し、3日ごとに培地を交換します。Von Kossa染色(ステップ1.4.2)に進み、各培養期間の終了時に鉱化した結節を評価します。
      5. 各ウェルから培地を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄します。細胞を2 mLの70%エタノールで室温(RT)で一晩固定します。細胞を流水で注意深く洗います。
      6. 5%硝酸銀溶液2 mLを加え、プレートを紫外線で1時間インキュベートします。細胞を蒸留水で洗浄します。5%チオ硫酸ナトリウム2mLを加え、5分間インキュベートします。蒸留水で洗ってください。
      7. 2 mLのエオシンで40秒間対比染色します。染色液が除去されるまで蒸留水で洗浄し、光学顕微鏡で染色を可視化します。
   3. 機能特性評価:脂肪形成分化
      1. トリプシン/EDTAを使用して細胞を分離し(ステップ2.3.1から2.3.2を参照)、細胞を収集および遠心分離し(ステップ2.4.1.2および2.4.1.2を参照)、カウントします(ステップ2.2.4を参照)。
      2. プレート:2 x 10 5細胞/ウェル、基礎内側の6ウェルプレート(DMEMに10%FBSおよび1%抗生物質を補充)。37°Cで5%CO₂中でインキュベートします。
         注:分化時間(14日と21日)ごとに1つずつ、合計2枚の6ウェルプレートが必要です。
      3. 翌日、培地を脂肪形成培地に変更します(ステップ2.5.1)。
         注:基礎培地のみをコントロールとして培養する3つのウェルを予約します。
      4. 細胞を脂肪形成培地で14日間および21日間培養し、3日ごとに培地を交換します。各培養期間の終了時に、細胞内脂質蓄積の指標であるOil-Red O染色(ステップ2.4.3.5-2.4.3.7)に進みます。
      5. 各ウェルからメディアを吸引します。細胞をPBSで2回洗浄します。細胞を2mLの10%ホルマリンに1時間固定します。PBSで一度洗い、次に水で1回洗います。
      6. 2 mLのOil-Red O溶液を60%イソプロパノール溶液で5分間染色します。蒸留水で一度洗ってください。
      7. 蒸留水で1:2に希釈した1%ヘマトキシリン2mLで1分間対比染色します。染色液が除去されるまで蒸留水で洗浄し、光学顕微鏡を用いて染色されたサンプルを可視化します。
   4. 機能的特性評価:軟骨分化
      1. トリプシン/EDTAを使用して細胞を分離し(ステップ2.3.1から2.3.2を参照)、細胞を収集および遠心分離し(ステップ2.4.1.2および2.4.1.2を参照)、カウントします(ステップ2.2.4を参照)。
      2. 5 x 10⁵ ADSCを4本のポリプロピレン円錐管に入れ、450 x g で5分間遠心分離してペレットを形成します。上清を捨てます。
      3. 円錐形チューブ内でペレットを軟骨形成培地(ステップ1.6.1)または基礎培地のみ(分化の制御)で14日間および21日間、37°Cの5%CO₂で培養します。3日ごとに培地を交換し、ペレットの除去を避けてください。
         注:各細胞ペレットは、各培養時間、および基礎培地のみで増殖したそれぞれのコントロールを指します。
      4. 各培養時間の終わりに、細いピンセットを使用してペレットを回収し、24ウェルプレートに入れます。プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンの組織学的切片作製および染色に進みます(ステップ2.4.4.5.-2.4.4.9)。
         注:各ペレットは別々のウェルで処理されます。
      5. ペレットを10%緩衝ホルムアルデヒド2mLに30分間固定します。ホルムアルデヒド溶液を捨て、2mLの70%エタノールを加えます。先端を使用して円錐形チューブからペレットを取り出し、ペレットをパラフィンに埋め込みます。
      6. 回転するパラフィンミクロトームを使用して、5 μmの組織切片を作成します。切片を60°Cで15分間インキュベートし、キシレンに2回(5分および15分)浸します。
      7. 組織切片をアルコール浴にそれぞれ2分間ずつ減らして(100%、96%、80%、70%)浸してサンプルを再水和し、次いで脱イオン水で5分間すすぎます。
      8. アルシアンブルー1%酢酸、pH 2.5でサンプルを30分間染色します。
      9. ヘマトキシリンで1分間対比染色し、蒸留水で洗浄します。DPX(組織学用マウンタント)などのマウント液でマウントし、光学顕微鏡でサンプルを可視化します。

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結果

ここに提示されたプロトコルに従って脂肪組織から抽出された細胞は、ISCTによって提案されたMSCの最小基準に一致する形態を示しました。プロトコルの概要を 図 1 に示します。表現型的には、ADSCは細胞培養の最初の数日間に可塑性および線維芽細胞様形態への付着を示しました(図2A)。さらに、それらは均質に成長し、コロニーを形成しました。...

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ディスカッション

MSCは、さまざまな組織から抽出できます。骨髄はマウスとヒトの両方でMSCの一般的な供給源であるにもかかわらず^25,26、この研究では、MSCが豊富であること、体内での分布、およびアクセスの容易さから、脂肪組織を扱うことを選択しました。代替として、脂肪由来幹細胞を使用して、MSC様の不死化細胞²⁷を生成することができる?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)