フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞へのmiRNA放出の追跡

要約

ここでは、マイクロRNAパッケージングと細胞外小胞(EV)への輸出のダイナミクスを研究するために、蛍光標識されたマイクロRNAの存在量の in vitro 評価を可能にする簡単なプロトコルについて説明します。

要約

細胞外小胞(EV)は、さまざまな細胞から分泌される細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターです。これらのEVは、タンパク質、脂質、核酸(DNA、mRNA、マイクロRNA、その他のノンコーディングRNA)などの生理活性分子をある細胞から別の細胞にシャトルし、レシピエント細胞に表現型の結果をもたらします。さまざまなEVカーゴの中でも、マイクロRNA(miRNA)は、EVに明らかな調節不全と存在量があるため、微小環境の形成やレシピエント細胞の教育に果たす役割で大きな注目を集めています。追加のデータは、多くのmiRNAがEVに能動的にロードされていることを示しています。このような明確な証拠があるにもかかわらず、miRNAの輸送動態や選別機構に関する研究は限られています。ここでは、EV-miRNAローディングの動態を理解し、miRNAの輸送に関与するメカニズムを特定するために使用できる、EV-miRNAのフローサイトメトリー解析を用いたプロトコルを提供します。このプロトコルでは、EVで濃縮され、ドナー細胞から枯渇するようにあらかじめ決められたmiRNAは、蛍光色素に結合し、ドナー細胞にトランスフェクトされます。次に、蛍光標識されたmiRNAを、qRT-PCRを用いてEVへのロードと細胞からの枯渇について検証します。トランスフェクションコントロールおよびトランスフェクションされた細胞集団をゲーティングするためのツールの両方として、蛍光標識された細胞RNA(細胞保持およびEV枯渇)が含まれています。EV-miRNA と cell-retained-miRNA の両方をトランスフェクションした細胞は、72 時間にわたって蛍光シグナルについて評価されます。EV-miRNAに特異的な蛍光シグナル強度は、細胞保持miRNAと比較して急速に減少します。この簡単なプロトコルを使用することで、miRNAローディングのダイナミクスを評価し、miRNAをEVにロードするさまざまな要因を特定することができます。

概要

マイクロRNA(miRNA)は、転写後遺伝子制御における重要な役割で知られる低分子ノンコーディングRNAのサブセットの中でも、最もよく特徴付けられているものの1つです。ほとんどのmiRNAの発現と生合成は、核内の一次miRNA(pri-miRNA)の転写から始まる一連のイベントが調整されています。マイクロプロセッサ複合体による前駆体miRNA(pre-miRNA)への核プロセシングに続いて、pre-miRNAは細胞質に輸送され、RNase IIIエンドヌクレアーゼによってさらにプロセシングされ、21〜23ヌクレオチド成熟miRNA二本鎖にダイサー^{されます1。}プロセシングされた成熟miRNAの鎖の1本が標的メッセンジャーRNA(mRNA)に結合し、標的の分解または翻訳抑制を引き起こします²。複数の多様な標的mRNAを同時に制御するmiRNAの多面的役割に基づけば、miRNAの発現が厳密に制御されていることは驚くべきことではありません³。実際、不適切な発現は、特に癌において、さまざまな病態の一因となります。miRNAの異常な発現は、疾患特異的な特徴を表すだけでなく、予後および治療の可能性の標的としても浮上しています^4,5,6

プロトコル

注:この手法を使用するための前提条件として、選択的にエクスポートされた miRNA の同定と検証が必要です。細胞株は、EVにソートされたmiRNAカーゴによって異なるため、使用前に目的の細胞株および関連するEVのmiRNAを評価することをお勧めします。さらに、リポフェクタミンベースのトランスフェクションは、プロトコルの重要なステップの1つです。実験を設定する前に、トランスフェクション効率を事前に決定することをお勧めします。

1. 培養細胞の増殖と蛍光色素標識EV-miRNAによる細胞のトランスフェクション

1. 200,000〜400,000個の細胞を、適切な培地の6ウェルプレートの3重ウェルに播種します。プレートを静かに旋回させて、細胞の分布を均一にします。細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するまで、約24〜48時間インキュベートします。
2. トランスフェクションするウェルごとに、製造元の指示に従って、トランスフェクション試薬を微量遠心チューブ内の無血清培地100 μLで希釈します。
   注:脂質の最適濃度は、このセットアップの前に、目的の細胞株について決定する必要があります。
3. トランスフェクションする各ウェルについて、蛍光色素標識EV-miRNA(2 nM)と細胞-miRNA(2 nM)を微量遠心チューブ内で100 μLの無血清培地で別々に希釈します。
   注:総容量は、トランス....

ディスカッション

新たに確立されたプロトコルにより、EV-miRNAのトランスフェクション後のEVへのmiRNA放出の動態を捕捉することができます。このアプローチでは、サイトメーターの能力に応じて、複数のEV-miRNAと細胞miRNAの同時解析が可能になります。さらに、フローサイトメトリー解析はEV miRNAの生物学に関する貴重な洞察を提供することができますが、限界がないわけではありません。ただし、いくつかの?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A