ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞の精製のための細胞選別における生ミトコンドリア染色の応用

要約

多能性幹細胞に由来する肝細胞は、ミトコンドリアと活性化白血球細胞接着分子(ALCAM、CD166)染色の組み合わせを使用して、細胞選別によって精製できます。

要約

ヒト胚性幹細胞(ES)細胞や人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、その無限の増殖性と多能性により、重篤な臓器の治療に応用できる可能性が期待されています。しかし、ヒトES/iPS細胞を100%純粋な標的細胞に分化させることは、環境に対する感度が高いため困難です。移植後の腫瘍形成は、汚染された細胞、増殖する細胞、未分化細胞によって引き起こされるため、再生医療を安全に実現するためには、高精製技術が不可欠です。腫瘍形成のリスクを軽減するために、ヒトiPS細胞由来肝細胞を対象とした高精製技術が開発されました。この方法は、高ミトコンドリア含有量と細胞表面マーカーALCAM(活性化白血球接着分子)を遺伝子組み換えなしで組み合わせたFACS(蛍光活性化細胞ソーティング)を採用しています。この方法を用いて精製された肝細胞の97%±0.38%(n = 5)は、アルブミンタンパク質の発現を示した。本稿では、ヒトiPS細胞の肝細胞への最新の二次元分化法に適用された、この方法の詳細な手順を提供することを目的としています。

概要

胚性幹細胞と人工多能性幹細胞(ESおよびiPS細胞)は、再生治療の有望な細胞源と考えられています。しかし、これらの細胞を特定の標的細胞型に分化する効率は、同じ細胞株、プロトコール、および実験者1,2,3,4を使用する場合でも、異なる可能性があります。このばらつきは、ヒトES/iPS細胞の環境に対する感度が高いことに起因していると考えられます。そのため、純粋な標的細胞を安定して得ることは現状では困難です。安全性の高い再生医療を実現するためには、治療用細胞から増殖細胞や未分化幹細胞を排除することが重要であり、標的細胞の高度な精製技術が不可欠^{である5,6,7}。

セルソーターは、個々の細胞を瞬時に解析し、蛍光シグナルの強度に基づいて目的の生細胞を選別する装置で、有望なソリューションを提供します。これは、細胞タイプ特異的な表面マーカーの抗体染色、または細胞タイプ特異的なレポーター遺伝子発現を利用することで達成できます。この技術を用いて、多能性幹細胞....

プロトコル

本研究では、市販のヒトiPS細胞(253G1系統)を使用しました( 材料表参照)。

1. ヒトiPS細胞のメンテナンス

1. 0.25 μg/cm² iMatrix-511 をコーティングした培養皿に、AK02 培地でヒト iPS 細胞をフィーダーフリー状態で保持します ( 材料表を参照)。

2. 2D培養におけるヒトiPS細胞の肝臓分化

注:肝臓分化の毎日のスケジュールについては、 図1A を参照してください。.プロセス全体を通して、6ウェル培養プレートを使用し、指定された洗浄液または培地2 mLを各ウェルに加えます。細胞培養条件を湿度100%、_CO25%、_O20 %、37°Cで維持します。

1. 6ウェルプレートの各ウェルに1 mLの基底膜マトリックス(PBS(-)で1/25に希釈)をコーティングし、37°Cで1時間インキュベートします。
2. 10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加したAK02N培地を使用して、20,000〜30,000細....

ディスカッション

肝細胞は、栄養素の代謝と解毒におけるそれらの機能のために、他の細胞タイプと比較して比較的多くのミトコンドリアを持っています¹⁵。ALCAMは免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であり、細胞の接着と遊走に役割を果たします。それは、肝臓細胞、上皮細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、およびニューロン細胞¹⁶を含む様々な細胞タイ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK inhibitor
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159