両性における多発性硬化症のモデル化:MOG35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎

要約

実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症の最も広く使用されているマウスモデルの1つです。現在のプロトコルでは、雌雄のC57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドを免疫し、主に尾と四肢の上行麻痺を引き起こします。ここでは、EAEの誘導と評価のプロトコルについて説明します。

要約

多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)に影響を与える慢性自己免疫性炎症性疾患です。これは、性別で有病率が異なり、男性よりも女性に多く影響し、結果が異なり、女性よりも男性でより攻撃的な形態を示すことを特徴としています。さらに、MSは、臨床的側面、放射線学的、および病理学的特徴の点で非常に異質です。したがって、病理学のできるだけ多くの側面の調査を可能にする実験動物モデルを利用する必要があります。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、マウスで最もよく使用されるMSモデルの1つであり、免疫系の活性化から中枢神経系の損傷まで、さまざまな疾患の特徴をモデル化しています。ここでは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(MOG_35-55)免疫を使用して、雌雄のC57BL / 6JマウスにEAEを誘導するためのプロトコルについて説明します。また、これらのマウスの免疫後28日間(28dpi)の毎日の臨床スコアと運動能力の評価についても報告します。最後に、中枢神経系レベルでの基本的な組織学的解析を、疾患誘発性損傷の原発部位としての脊髄に焦点をあてて説明する。

概要

多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)に影響を与える慢性自己免疫性炎症性疾患です。炎症細胞の血管周囲浸潤、脱髄、軸索喪失、およびグリオーシスの存在^{を示します1。}その病因は不明のままであり、その臨床的側面、X線写真、および病理学的特徴は、この疾患の顕著な異質性を示唆しています²。

その病因と複雑さが不明なため、現在のところ、ヒト^MS3,4に示されたすべての臨床的および放射線学的特徴を再現する動物モデルはありません。しかし、MS ^3,4のさまざまな側面を研究するために、さまざまな動物モデルが採用されています。これらのモデルでは、疾患の開始は通常、非常に人工的であり、臨床徴候の発症の時間枠はヒトとマウスで異なります。例えば、ヒトでは、疾患の根底にある病態生理学的過程は、臨床症状の発症前に何年も検出されない。逆に、実験者は、MS導入後数週間または数日以内に動物モデルの症状を検出する^{ことができます4。}

MSに特徴的な脱髄の特徴は、ウイルス誘発性モデル(....

プロトコル

本作業における動物の飼育と取り扱いは、2010^年9 月22日の欧州連合理事会指令(2010/63/UE)に従って行われました。本研究で報告されたすべての手順は、イタリア保健省(407/2018-PR)およびトリノ大学の倫理委員会(プロジェクトn°360384)によって承認されました。2010年にKilkennyらによって最初に発表されたARRIVEガイドラインに実験計画に準拠することをお勧めします²⁰。開始する前に、必要な材料が揃っていることを確認してください( 材料表を参照)。MOG_35-55 エマルジョンの調製に使用されるすべてのガラス器具および調理器具をオートクレーブで滅菌します。実験手順の概要を 図1に示します。

1. MOG_35-55 エマルジョンの調製

注:エマルジョンを調製するには、MOG_35-55、不完全フロイトアジュバント(IFA)、 結核菌 株H37Ra(MT)、および生理学的溶液が必要です( 材料表を参照)。

ディスカッション

我々が記述したMOG_35-55誘導EAEプロトコルは、C57BL/6Jマウス^7,8,13において慢性型MSの発症につながりました。これらの代表的な結果では、免疫処置を受けた雌雄ともに慢性疾患を発症した(発症後に完全に回復せず、欠損を蓄積し、慢性期でCS1.5以上を維持する)ことを報告した。

多くの研究が、こ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic