Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウ ジョウバエ モデルに対するカルシウムイメージング

要約

ここでは、てんかん様活性をモニターするために、GCaMP6を発現する成虫ショウジョウバエのex vivoカルシウムイメージングのプロトコルを紹介します。プロトコルは細胞レベルでのてんかんの潜在的なメカニズムの調査を可能にする前の生体内カルシウムイメージ投射によって大人のショウジョウバエのictalでき事を調査するための貴重な用具を提供する。

要約

てんかんは、発作の再発を特徴とする神経疾患であり、遺伝的起源と部分的に相関しており、世界中で7,000万人以上が罹患しています。てんかんの臨床的重要性にもかかわらず、中枢神経系における神経活動の機能分析はまだ開発されていません。近年のイメージング技術の進歩は、GCaMP6などの遺伝的にコードされたカルシウム指標の安定発現と相まって、脳全体および単一細胞の分解能レベルでてんかんの研究に革命をもたらしました。ショウジョウバエは、その高度な分子遺伝学と行動アッセイにより、てんかんの根底にある分子および細胞メカニズムを調査するためのツールとして登場しました。この研究では、GCaMP6を発現する成虫ショウジョウバエのex vivoカルシウムイメージングのための新しい効率的なプロトコルを提示し、てんかん様活性を監視します。脳全体は、よく知られているてんかん遺伝子であるcacから調製され、共焦点顕微鏡でカルシウムイメージングを行い、前髪感受性発作様行動アッセイのフォローアップとして神経活動を特定します。CACノックダウンバエは、野生型ハエよりも発作様行動と異常なカルシウム活性の割合が高く、大きなトゲが多く、小さなトゲが少ないなどを示しました。カルシウム活性は発作様行動と相関していた。この方法論は、てんかんの病原性遺伝子をスクリーニングし、細胞レベルでてんかんの潜在的なメカニズムを探る上で効率的な方法論として機能します。

概要

てんかんは、自発的な発作や予期せぬ発作の再発や神経回路の異常な活動を特徴とする複雑な慢性神経疾患で、世界中で7,000万人以上が罹患しており、最も一般的な神経疾患¹の1つであり、家族や社会の負担が大きい疾患となっています。てんかんの影響を考慮して、発作の病因を特定するために多くの研究が行われており、遺伝学は多くの種類のてんかんまたはてんかん症候群の主な原因として承認されています²。過去数十年にわたり、ゲノム技術の進歩により、イオンチャネル遺伝子や非イオンチャネル遺伝子など、発作の発生に重要な役割を果たす新しいてんかん関連遺伝子の発見が急速に増加しています^3,4。しかし、遺伝子とてんかん表現型の間の根本的なメカニズムと機能解析は完全には理解されていません。てんかん関連の遺伝子とメカニズムを特定することは、患者の効率的な管理の可能性を提供します^5,6。

細胞質カルシウムシグナルは、ニューロンの活動とシナプス伝達における極めて重要な要素です。1970年代以降、脳スライス⁷、in vivo8,9

プロトコル

1. 前髪感受性アッセイのプロトコール

1. Gal4/UASシステム²¹を介して、tub-Gal4ドライバーラインとUAS-cac-RNAiラインを交差させることにより、実験用ハエを確立します。tub-Gal4系統の処女バエとUAS-cac-RNAi系統のオスバエを採集します。次に、処女と雄のハエを同じバイアルに移して子孫を収穫します。
   注: tub-Gal4 ドライバーラインは、 cac 遺伝子の全体的なノックダウンを達成することができます。 UAS-cac-RNAi 株をコントロールグループとして使用します。
2. 3〜5日後、100%_CO2 (_CO2 麻酔装置)を使用してハエを静かに麻酔し、 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi ハエと UAS-cac-RNAi ハエの両方をブラシで収集します。これらのハエを検査の1日前に新しい清潔な食品バイアルに移し、十分に準備されていることを確認します。
3. _CO2を使用してハエを穏やかに麻酔します。麻酔をかけたら、4〜6匹のハエを個々の新しいバイアルに慎重に入れます。ハエが麻酔から約1時間回復してから、テストに進みます。

ディスカッション

カルシウムイオンは重要なセカンドメッセンジャーとして機能し、化学的および電気的摂動の両方に対するさまざまな生理学的および病態生理学的応答において極めて重要な役割を果たします。さらに、ヒトCACNA1A遺伝子によってコードされるシナプス前P/Qチャネルのトポロジカル要素は、グルタミン酸^30,31,32を含む.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushes	Panera	AAhc022-2	for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Confocal microscope	SP8; Zeiss, Jena, Germany.	N/A	for calcium imaging
CO2 anesthesia machine	N/A	N/A	for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder	N/A	N/A	handmade, for mounting the brain
Culture vials	Biologix	51-0500	2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	version: 2.14.0	for analysis
Fly morgue	N/A	N/A	handmade, for handling flies
Fly stocks	cac-RNAi	27244	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
High-resolution camera	N/A	N/A	for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Papain suspension	Worthington Biochemical	LS003126
Petri dishes	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	for dissection
Pipette	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Recording dish	Thermo Scientific	150682- Glass Based Dish	for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Stereo-binocular microscope	SHANG GUANG	XTZ-D	for handling flies and dissection
Syringe needles	pythonbio	HCL0693	for dissection
Tripod	WEIFENG	45634732523	for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer	Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich	Z653438	for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard	N/A	N/A	handmade, foam pad or paper for background