プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語)

要約

本プロトコルは、機能化された磁気ビーズを利用して尿中細胞外小胞を効率的に隔離するための詳細な説明を提供します。さらに、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、リン酸化プロテオミクスなどのその後の分析も網羅しています。

要約

生体液由来の細胞外小胞(EV)は、近年、リキッドバイオプシーの分野で大きな注目を集めています。ほぼすべての種類の細胞から放出され、宿主細胞のリアルタイムスナップショットを提供し、細胞機能や疾患の発症および進行の主要なプレーヤーとして、タンパク質、特にリン酸化などの翻訳後修飾(PTM)を持つタンパク質を含む豊富な分子情報が含まれています。しかし、現在のEV単離法では収率や不純物が少ないため、生体液からのEVの単離は依然として困難であり、EVリン酸化タンパク質などのEV貨物の下流分析は困難です。ここでは、ヒト尿などの生体液からのEV単離のための官能基化磁気ビーズに基づく迅速で効果的なEV単離法と、EV単離後の下流プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析について説明します。このプロトコルにより、尿中EVの高い回収率と、EVプロテオームおよびリン酸化プロテオームの高感度プロファイルが可能になりました。さらに、このプロトコルの汎用性と関連する技術的考慮事項についてもここで説明します。

概要

細胞外小胞(EV)は、あらゆる種類の細胞から分泌される膜内包ナノ粒子であり、血液、尿、唾液などの体液中に存在します1,2,3,4。EVは、宿主細胞の生理学的および病理学的状態を反映する多様な生理活性分子の貨物を運んでいるため、疾患の進行における重要な要因として機能します^4,5,6。さらに、広範な研究により、症状の発症または腫瘍の生理学的検出の前に、EVベースの疾患マーカーを特定できることが確立されています^5,6,7。

リン酸化は、細胞のシグナル伝達と調節における重要なメカニズムとして作用します。したがって、リン酸化タンパク質は、異常なリン酸化イベントが細胞シグナル伝達経路の調節不全や癌などの転移性疾患の発症と関連しているため、バイオマーカー発見のための貴重な情報源を提供します^8,9,10。リン酸化動態のプロファイリングにより、疾患特異的なリン酸化タンパク質シグネチャーを潜在的なバイオマーカーとして同定することができますが、リン酸化タンパク質の存在量が少なく、動的な性質は、バイオマーカーとしてのリン酸化タンパク質の開発において大きな課題となっています^11,12。特に、EV内に内包された低存在量のリン酸化タンパク質は、細胞外環境での外部酵素消化から保護されています⁸。したがって、EVおよびEV由来のリン酸化タンパク質は、がんやその他の疾患の早期発見におけるバイオマーカー発見の理想的な情報源となります。

EVにおけるタンパク質のリン酸化の解析は、がんのシグナル伝達と早期疾患診断を理解するための貴重なリソースを提供しますが、効率的なEV分離法の欠如が大きな障壁となっています。EVの絶縁は、通常、差動超遠心分離(DUC)によって実現されます¹³。しかし、この方法は時間がかかり、スループットが低く再現性が低いため、臨床的な意味合いには適していません^13,14。ポリマー誘起沈殿¹⁵などの代替EV単離アプローチは、非EVタンパク質の共沈による特異性の低さによって制限される。抗体ベースのアフィニティー捕捉¹⁶ やアフィニティー濾過¹⁷ などのアフィニティーベースのアプローチは、特異性を高めますが、容量が少ないため、回収率が比較的低く制限されます。

EVのリン酸化蛋白質動態を探る上での課題を解決するため、当グループでは、EVを機能性磁気ビーズに捕捉する化学的親和性に基づく細胞外小胞全回収精製(EVtrap)技術を開発しました¹⁸。これまでの結果から、この磁気ビーズベースのEV分離法は、幅広い生体液サンプルからEVを分離するのに非常に効果的であり、DUCや他の既存の分離方法と比較して、汚染を最小限に抑えながらはるかに高いEV収率を達成できることが実証されています^18,19。私たちは、EVtrapと私たちのグループによって開発されたチタンベースのリン酸化ペプチド濃縮法を利用することに成功しました²⁰ 多様な生体液に由来するEVのリン酸化プロテオームをプロファイリングし、さまざまな疾患の潜在的なリン酸化タンパク質バイオマーカーを検出します19,21,22。

ここでは、流通するEVを分離するためのEVtrapに基づくプロトコルを紹介します。このプロトコルは、尿路EVに焦点を当てています。また、ウェスタンブロッティングを用いた絶縁型EVの特性評価についても実証しています。次に、プロテオミクス分析とリン酸化プロテオミクス分析の両方のためのサンプル調製と質量分析(MS)取得について詳しく説明します。このプロトコルは、尿中EVプロテオームとリン酸化プロテオームをプロファイリングするための効率的で再現性のあるワークフローを提供し、EVとその臨床応用に関するさらなる研究を促進します²³。

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プロトコル

すべての尿サンプルは、インフォームドコンセント後に健康な個人から収集されました。実験は、ヒトサンプルを含むすべての倫理基準に準拠しており、パデュー大学ヒト研究保護プログラムのガイドラインに準拠しています。

1. 検体採取

1. 15 mLのコニカル遠心チューブで12 mLの尿サンプルを2,500 x g、4°Cで10分間遠心分離し、細胞の破片や大きなアポトーシス体を除去します。
2. 上清 10 mL を新しい 15 mL チューブに移し、EV 単離を進めます。
   注:プロトコルはここで一時停止でき、サンプルは-80°Cで保存し、使用時に37°Cで解凍できます。

2. EVtrapアプローチによるEV絶縁

1. メーカーの指示に従って、0.5 mLのローディングバッファー(1:10 v/v比)と100 μLのEVtrapビーズスラリー(1:50 v/v比)をサンプルに加えます。
2. サンプルを端から端まで回転させて、室温で30分間インキュベートします。
3. 15 mLのコニカルチューブを磁気セパレーターラックに置いて、サンプルをペレット化します。上澄みを取り除きます。
4. ビーズを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。ピペットで静かに動かし、EVバウンドビーズを再懸濁します。
5. チューブを1.5 mLの微量遠心チューブの磁気セパレーターラックに置き、上清を吸引します。P200ピペットを使用して上清を完全に吸引し、ビーズを吸引しないようにします。
6. ビーズを1 mLの洗浄バッファーで洗浄します。上澄み液を吸引した直後に緩衝液を添加し、ビーズの乾燥を防ぎます。
7. ビーズを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で室温で2回洗浄します。
8. ビーズを調製したばかりの100 mMトリエチルアミン100 μLと室温で10分間インキュベートし、1.5 mLの微量遠心チューブ磁気セパレーターラックを使用してEVを含む溶出溶液を回収します。
   注:1 mL の 100 mM トリエチルアミンを調製するには、14 μL のトリエチルアミン溶液を水で希釈します。
9. ステップ 2.8 を繰り返して、溶出した溶液を混合します。4°Cの真空遠心濃縮機を使用して溶出液を乾燥させます。
   注: 実験はここで一時停止できます。乾燥したEVサンプルは、-80°Cで数ヶ月間保存でき、次のステップや結果に悪影響を与えることはありません。

3. ウェスタンブロッティングによるEVの特性評価

1. 乾燥した EV サンプルの 5%(尿サンプル 0.5 mL に相当)を、10 mM ジチオスレイトール(DTT)を含む 1x ドデシル硫酸リチウム(LDS)サンプルバッファー 20 μL に再懸濁します。
   注:0.5 mLの尿からのEVは、ウェスタンブロッティングでCD9(EV^{マーカー24})シグナルを検出するのに十分です。
2. サンプルを95°Cで5分間煮沸します。 サンプルをポリアクリルアミドゲルにロードし、標準プロトコル²⁵に従って電気泳動とイムノブロッティングを行います。
3. タンパク質を低蛍光ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに転写した後、トリス緩衝生理食塩水トゥイーン-20(TBST)中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)でメンブレンを室温で1時間ブロックします。TBST バッファー 1 L を調製するには、19 mM トリス塩基、137 mM NaCl、および 1 mL の Tween-20 を加えます。HClを使用してpHを7.4に調整します。
4. ウサギ抗CD9抗体を1:5,000の比率で1%BSAのTBSTで4°Cで一晩、または室温で2時間インキュベートします。
5. メンブレンをTBSTでそれぞれ5分間3回洗浄します。メンブレンを抗ウサギIgG、HRP結合二次抗体と1:5000の比率でTBST中の1%BSAで室温で1時間インキュベートします。
6. メンブレンをTBSTでそれぞれ5分間3回洗浄します。市販の増強化学発光(ECL)基質(1:1の比率)をメンブレンに添加し、化学発光イメージングシステムでシグナルを検出します。

4. プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のためのサンプル調製

1. 12 mM デオキシコール酸ナトリウム(SDC)、12 mM ラウロイルサルコシンナトリウム(SLS)、100 mM 重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー(TEAB)、10 mM トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、40 mM クロロアセトアミド(CAA)、およびホスファターゼ阻害剤カクテル 1 個を含む新鮮な溶解バッファーを調製します。
   注:ストック溶液は、 材料表の説明に記載されています。溶解緩衝液は、必要な容量に応じて所望の濃度になるようにストック溶液を添加することによって調製されます。
2. 乾燥したEVサンプルを100 μLの溶解緩衝液に可溶化し、1,100rpmで振とうしながらサンプルを95°Cで10分間加熱します。
3. サンプルを室温まで冷却した後、400 μL の 50 mM TEAB を添加して 5 倍に希釈します。
4. 製造元の指示に従って、BCAアッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定します。50 mM TEAB で 5 倍に希釈した溶解バッファーをブランクとして使用します。
5. 酵素とタンパク質の比率が1:50 w/wのトリプシン/Lys-Cミックスを添加し、サンプルを37°Cで一晩インキュベートし、1,100rpmで振とうします。
6. 50 μL の 10% トリフルオロ酢酸(TFA)を添加してサンプルを酸性化します。
7. 600 μL の酢酸エチルをサンプルに加え、混合物を 2 分間ボルテックスします。
8. サンプルを20,000 x g で3分間遠心分離し、上層(有機層)を除去します。吸引中に界面を乱さないようにしてください。
9. 手順4.7〜4.8を繰り返します。真空遠心濃縮機を使用して水相を乾燥させます。
10. 乾燥したサンプルを 200 μL の 0.1% TFA に再懸濁してペプチドを酸性化し、メーカーの指示に従って C18 脱塩チップを使用してサンプルを脱塩します。チップを 200 μL の 0.1% TFA 含有 80% アセトニトリルでコンディショニングし、続いて 200 μL の 0.1% TFA で 2 回コンディショニングします。酸性化したペプチドサンプルをチップにロードし、200 μL の 0.1% TFA でチップを 3 回洗浄します。200 μL の 0.1% TFA 含有 80% アセトニトリルでペプチドを溶出します。
11. 真空遠心濃縮機を使用して溶出液を乾燥させます。プロテオミクス解析のために、ペプチドサンプルの2%(尿サンプル0.2 mLに相当)を別々に乾燥させます。サンプルの残り(98%)をリン酸化プロテオミクス分析に使用します。
12. 製造元の指示に従って、リン酸化ペプチド濃縮キットを使用してサンプルからリン酸化ペプチドを濃縮します。エンリッチメントについては、以下で説明する手順を実行します。
    1. 乾燥したサンプルを200 μLのローディングバッファーに再懸濁します。50 μLのビーズをサンプルに加え、室温で20分間激しく振とうします。ビーズを含むサンプルをフリットチップにロードし、100 x gで1分間遠心分離します。
    2. チップを 200 μL のローディングバッファーで洗浄し、続いて洗浄バッファー 1、洗浄バッファー 2 の順に洗浄します。20 x g で 2 分間、100 x g で 1 分間遠心分離して、3 つの洗浄ステップをすべて実行します。
    3. ビーズの入ったチップを新しいチューブに入れて、溶出したリン酸化ペプチドを回収します。チップに溶出バッファー50 μLを加え、20 x gで2分間遠心分離します 。 さらに50 μLの溶出バッファーをチップに加え、20 x gで2分間遠心分離します。最後にもう一度、100 x gで1分間遠心分離します。
13. 溶出したリン酸化ペプチドを真空遠心濃縮機で乾燥させます。

5. LC-MS/MS分析

注:さまざまな LC-MS/MS システム/設定、およびデータ依存性取得(DDA)などのデータ取得方法を使用できます。

1. 乾燥したプロテオーム/リン酸化プロテオームサンプルを0.1%ギ酸(溶媒A)に再懸濁し、メーカーの指示に従ってサンプルをロードします。
2. 液体クロマトグラフィー(LC)システムを介してトラップイオンモビリティー飛行時間型 MS にサンプルを注入し、プリセットの標準化された Whisper 40 サンプル/日メソッドを使用します。ペプチドは、 材料表に記載されているように、15 cm の C18 カラム(内径 75 μm、粒子径 1.9 μm)で分離されます。
3. プロテオミクス解析では、300-1200 m/z、0.6-1.50 1/K0 のランプあたりの質量範囲で、サイクルタイム 1.38 秒のパラレルアキュムレーションシリアルフラグメンテーションとデータ非依存取得(dia-PASEF)取得法を組み合わせてデータを取得します。
4. リン酸化プロテオミクス解析では、400-1550 m/z および 0.6-1.50 1/K0 のランプあたりの質量範囲で dia-PASEF 取得法を使用し、サイクルタイムは 1.38 秒でデータを取得します。
5. 生ファイルをプロテオミクスソフトウェアにロードし、ライブラリフリーのデータに依存しない取り込みワークフローを使用して、シグナルの抽出、同定、定量を行います。
   1. 検索設定には、 ホモ・サピエン スデータベース、トリプシン/P酵素を含む特定の消化物タイプ、7つの最小ペプチド長、52の最大ペプチド長、2つの切断ミス、固定修飾としてのシステインでのカルバミドメチル、アセチルタンパク質Nターム、メチオニンでの酸化、およびセリン、スレオニン、チロシンでのリン酸化(リン酸化プロテオミクス分析用)、および最大可変修飾として5を使用します。PSM、ペプチド、およびタンパク質群におけるFDRを0.01に設定します。
      注:このプロトコルでは、Spectronautソフトウェアが使用されました。DIA-NNやPEAKSなどの他のDIAデータ検索ソフトウェアも一般的に使用されています。DDAモードでデータを取得した場合は、MaxQuantやProteome Discovererなどのソフトウェアが該当します。

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結果

このプロトコールは、EVの単離から下流のプロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析までの包括的なワークフローを実証します(図1)。三重の尿サンプルはEV分離にかけられた。単離されたEVは、ウェスタンブロッティングによって特徴付けられ、その後、タンパク質抽出、酵素消化、ペプチドクリーンアップなどの質量分析ベースのプロテオミクスサンプル調製?...

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ディスカッション

EVの効果的な単離は、EV中の低存在量のタンパク質やリン酸化タンパク質を検出するために不可欠な前提条件です。このニーズを満たすための多くの方法が開発されているにもかかわらず、大多数は依然として回収率の低下や再現性の低さなどの制限に悩まされており、大規模な研究や日常的な臨床現場での利用を妨げています。DUCは一般にEV分離の最も一般的な方法と見なされており、通常?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007