パラフィン包埋肺癌組織のマルチプレックス免疫組織化学染色

要約

この実験プロトコルは、主にシングルチャネル抗体のインキュベーション条件を最適化し、抗体とチャネルの設定を調整して、臨床起源の肺癌組織における自家蛍光およびチャネルクロストークの問題を解決することにより、マルチプレックス免疫組織化学(IHC)染色法を説明および最適化します。

要約

肺がんは、世界中の悪性腫瘍関連の罹患率と死亡率の主な原因であり、複雑な腫瘍微小環境は肺がん患者の主要な死因と見なされてきました。腫瘍微小環境の複雑さには、腫瘍組織における細胞間関係を理解するための効果的な方法が必要です。マルチプレックス免疫組織化学(mIHC)技術は、腫瘍組織におけるシグナル伝達経路の上流および下流におけるタンパク質の発現の関係を推測し、臨床診断および治療計画を策定するための重要なツールとなっています。mIHCは、チラミンシグナル増幅(TSA)技術に基づく多盲検免疫蛍光染色法であり、同じ組織切片サンプル上の複数の標的分子を同時に検出して、異なるタンパク質共発現および共局在分析を実現できます。この実験プロトコルでは、臨床起源の肺扁平上皮癌のパラフィン包埋組織切片をマルチプレックス免疫組織化学的染色に供した。実験プロトコルを最適化することにより、標識された標的細胞およびタンパク質のマルチプレックス免疫組織化学的染色が達成され、肺組織における自家蛍光およびチャネルクロストークの問題を解決しました。さらに、マルチプレックス免疫組織化学的染色は、シングルセルシーケンシング、プロテオミクス、組織空間シーケンシングなど、腫瘍関連のハイスループットシーケンシングの実験的バリデーションに広く使用されており、直感的で視覚的な病理学バリデーション結果を提供します。

概要

20年以上の歴史を持つチラミンシグナル増幅(TSA)は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を使用して標的抗原を高密度in situ標識するアッセイ技術の一種であり、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、in situハイブリダイゼーション(ISH)、免疫組織化学(IHC)、およびその他の生物学的抗原検出技術に広く適用されています。 検出信号¹の感度を大幅に向上させる。TSA技術に基づくオパール多色染色は最近開発され、いくつかの研究で広く使用されています^2,3,4,5。従来の免疫蛍光染色(IF)は、さまざまなモデル生物の細胞や組織におけるタンパク質の分布を検出および比較するための簡単なツールを研究者に提供します。これは、抗体/抗原特異的結合に基づいており、直接的および間接^{的なアプローチが含まれます}6。直接免疫染色では、目的の抗原に対する蛍光色素標識一次抗体を使用し、蛍光顕微鏡を使用した直接蛍光検出を可能にします。間接免疫染色法では、非標識一次抗体に対して蛍光色素標識二次抗体を添加します^6,....

プロトコル

このプロトコルは、中国四川大学華西病院の倫理委員会のガイドラインによって承認されています。肺がん組織サンプルは、中国西部病院の肺がんセンターでの手術中に採取され、各患者からインフォームドコンセントが得られました。

1. 組織切片の準備

1. FFPE調製
   1. 臨床組織を中性ホルマリン溶液に72時間以上浸します。
   2. キシレンと段階的なアルコール溶液を使用して組織を脱水するプロセスを完了します²⁰。
   3. 手動パラフィン包埋と組織切片作成を切片の厚さ4 μmで行います。癒着顕微鏡のスライドを使用して、組織スライスが脱落しないようにします。
   4. スライドを65°Cのオーブンで2時間焼き、ティッシュとスライドが乾いていることを確認します。スライドボックスに常温で保管してください。
2. 組織切開前処理
   1. 組織スライドを65°Cのオーブンで5分間前処理し、次にキシレン溶液に2 x 15分間、無水エタノール溶液に2 x 15分間、90%エタノール溶液に10分間、85%エタノール溶液に10分間、80%エタノール溶液に10分間、および75%エタノール溶液に10分間、順次浸します。 続いて、スライドを滅菌水で3 x 1分間洗浄します。
      注:この実験手法は、複数の高温抗原修復プロセス....

ディスカッション

mIHCは、複数のタンパク質マーカーを単一組織切片の単一細胞レベルで定量的および空間的に分析するための科学研究の分野で不可欠な実験技術であり、元の組織のコンテキストにおける詳細な組織構造と細胞相互作用に焦点を当てることにより、疾患病態の研究に直感的で正確なデータを提供します。mIHC技術の普及には、最適化された効果的な実験プロトコルが必要です。実験で発生する?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
Software
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.