機械的に単離されたStromal Vascular画分およびFibrinのヒドロゲルの組合せ:処理のプロトコール

要約

機械的に単離された間質血管画分(SVF)とフィブリンハイドロゲルの組み合わせは、組織工学や創傷治癒目的など、さまざまな適応症で生存脂肪由来の間質細胞の容易で効率的なキャリアを提供します。ここでは、トランスレーショナルリサーチおよび臨床応用のための機械的SVF(mSVF)-フィブリンハイドロゲルコンストラクトの調製について紹介します。

要約

脂肪由来間質細胞(ASC)の再生能は、再生研究やトランスレーショナル研究において大きな注目を集めています。これまで、脂肪組織からこれらの細胞を抽出するには、多段階の酵素ベースのプロセスが必要であり、その結果、ACSと他の細胞からなる不均一な細胞ミックスが得られ、これらは総称して間質血管画分(SVF)と呼ばれます。最近導入されたメカニカルSVF(mSVF)分離プロトコルは、時間がかかりにくく、規制上の懸念を回避します。 私たちは最近、乳化と遠心分離の組み合わせに基づいて間質細胞に富むmSVFを生成するプロトコルを提案しました。mSVFの創傷治療アプリケーションにおける現在の課題の1つは、機械的な操作や乾燥から保護する足場がないことです。フィブリンハイドロゲルは、過去に創傷治癒を目的とした細胞導入の有用な補助剤であることが示されています。本書の研究では、トランスレーショナルリサーチと臨床応用のための新しいアプローチとして、mSVF-フィブリンハイドロゲルコンストラクトの調製ステップを概説します。

概要

ここ数年で、再生形成外科は形成外科の新たな柱として浮上してきました¹。再生形成外科は、患者から採取した可溶性因子、細胞、組織を移植することで、損傷した組織を修復し、低侵襲で組織の修復を促進することを目的としています²。脂肪由来幹細胞(ASC)は、複数の間葉系に分化する能力があることから注目されており、再生医療研究の有望な候補となっています³。そのサイトカインプロファイルは、血管新生作用、免疫抑制作用、および抗酸化作用を示します⁴。

従来、ASCはコラゲナーゼを用いた酵素的アプローチを用いて脂肪組織から単離され、その結果、間質血管画分(SVF)が得られ、その後、これを培養してASCを取得しました。これらのラボベースの技術は、コストと時間がかかり、さらに重要なことに、厳しい規制制限を受けるため、臨床翻訳が複雑になります^5,6,7。対照的に、機械的に分離された間質血管画分(mSVF)プロトコルは、規....

プロトコル

この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。すべての成人ドナーは、収集した組織サンプルのさらなる使用を許可するための書面によるインフォームドコンセントを提供しました。このプロトコルは、当機関のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従っています。

1.脂肪組織の採取

1. 以前の出版物^26,27に記載されている従来の脂肪採取技術で標準的な脂肪吸引を行うことにより、脂肪組織を採取します。通常のリンガー乳酸とエピネフリンを1:200,000の比率で構成したチューメセントソリューションを使用してください。
2. 4mmの吸引カニューレを使用して、負圧と振動下で滅菌バッグに脂肪吸引を行います。採取した脂肪をすぐに実験室に移します。

2. mSVFアイソレーション

1. 細胞培養フードで次の手順(セクション 2 および 3)を実行し、無菌作業領域を確保します。生物学的安全性レベル2を確保するために、通常の白衣と手袋を着用してください。
2. 培地の準備:500 mLの高グルコースDulbecco's Modifie....

ディスカッション

SVFの機械的単離は、従来の酵素アプローチに代わるエレガントな選択肢を提供し、臨床応用のための幅広いアクセスを提供します²⁹。実際、mSVFは、本稿で提案されているように、瘢痕の軟部組織治療または美容処置の補助としてすでに臨床使用されています³⁰。ここで紹介するプロトコールは、生存可能なmSVF細胞を効率的に局所導.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Wellplate	Sarstedt	83.3921
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Biochemica	A1001.0010
50 mL-Falcon	Falcon	352070
Absorbent Towels, Two Pack	Halyard	89701
Alamar blue 25 mL	Invitrogen	DAL1025
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-500G
Biotek Cytation 5	Agilent		Cell Imaging Multimode Microplate Reader
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Cryostat	Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose,with L-Glutamine, with sodium pyruvate	VWR	392-0416
DPBS	Gibco	14190-144
Epinephrin	Sigma-Aldrich	E4250
Fetal Bovine Serum	Biowest	S181H-500
Fibrinogen Human Plasma 100 mg	Sigma-Aldrich	341576-100MG
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Formalin 4%	Formafix	1308069
FSC 22-Einbettmedium, blau	Biosystems	3801481S
Hematoxylin & Eosin Solution	Sigma-Aldrich	H3136 / HT110132
Lactated Ringer’s Solution 1000 mL	B Braun	R5410-01
Mercedes Cannula 4mm	MicroAire	PAL-R404LL
NaCl 0.9%	Bbraun	570160
OCT Embedding Matrix 125 mL	CellPath	KMA-0100-00A
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	10342243
PBS 1%	Sigma-Aldrich	P4474
PenStrep	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Petridish 150mm	Sarstedt	83.1803
Phalloidin-iFluor 488 Reagent	Abcam	ab176753
Sterile Syringe 20 mL Luer	HENKE-JECT	5200-000V0
Sterile Syringe 30 mL Luer-Lock	BD	10521
Thrombin from Human Plasma	Sigma-Aldrich	T6884-100UN
Tranexamic acid	Orpha Swiss	6837093
Tulipfilter 1.2	Lencion Surgical	ATLLLL
Tulipfilter 1.4	Lencion Surgical	ATLLLL