がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

要約

このプロトコルは、ハイスループットの基礎およびトランスレーショナルヒトがん研究を実行し、薬物スクリーニング、疾患モデリング、および個別化医療アプローチを進歩させるための生理学的に関連性のある腫瘍オンチップモデルを提示し、ローディング、メンテナンス、および評価手順を説明します。

要約

固形がんの腫瘍微小環境を in vitro で再現する検証済みのがんモデルの欠如は、前臨床がん研究および治療法開発の大きなボトルネックのままです。この問題を解決するために、私たちは、複雑なヒトの腫瘍微小環境を現実的にモデル化する微小生理学的システムである血管新生微小腫瘍(VMT)、または腫瘍チップを開発しました。VMTは、動的で生理学的フロー条件下で複数のヒト細胞タイプを共培養することにより、マイクロ流体プラットフォーム内で de novo を形成します。この組織工学的微小腫瘍コンストラクトは、生体内で新たに形成された血管と同様に、成長する腫瘍量をサポートする生きた灌流血管ネットワークを組み 込んでいます。重要なことは、薬物や免疫細胞が腫瘍に到達するには内皮層を通過する必要があり、治療の送達と有効性に対する in vivo の生理学的障壁をモデル化することです。VMTプラットフォームは光学的に透過性であるため、組織内の蛍光標識細胞を直接可視化することで、免疫細胞の血管外漏出や転移などの動的プロセスの高解像度イメージングを実現できます。さらに、VMTは、 in vivo 腫瘍の不均一性、遺伝子発現シグネチャー、および薬物応答を保持します。ほぼすべての腫瘍タイプをプラットフォームに適応させることができ、新鮮な手術組織からの初代細胞が増殖し、VMTでの薬物治療に反応し、真に個別化された医療への道を開きます。ここでは、VMTを確立し、腫瘍学研究に活用するための方法について概説します。この革新的なアプローチは、腫瘍と薬物反応の研究に新たな可能性を開き、研究者にがん研究を前進させるための強力なツールを提供します。

概要

がんは依然として世界的に大きな健康上の懸念事項であり、米国では死因の第2位となっています。国立保健統計センターは、2023年だけでも、米国で190万人以上の新規がん患者と60万人以上のがん死亡者が発生すると予想し^ており1、効果的な治療アプローチの緊急の必要性が浮き彫りになっています。しかし、現在、臨床試験に入った抗がん剤のうち、最終的にFDAの承認を得るのはわずか5.1%です。有望な候補が臨床試験を成功裏に進められないのは、前臨床^{医薬品開発中に}2D培養やスフェロイド培養などの非生理学的モデルシステムを使用することに部分的に起因している可能性があります2。これらの古典的ながんモデルには、治療抵抗性や疾患進行の重要な決定要因である間質ニッチ、関連する免疫細胞、灌流血管系など、腫瘍微小環境の本質的な構成要素が欠けています。したがって、前臨床所見の臨床的翻訳を改善するためには、ヒト のin vivo 腫瘍微小環境をよりよく模倣する新しいモデルシステムが必要です。

組織工学の分野は急速に進歩しており、実験室でヒトの疾患を研究するためのより良い方法を提供しています。重要な進展の1つは、臓器チップまたは組織チップとしても知られる微小生理学的システム(MPS)の出現であり、これは、健康な状態または病気の状態を再現できる機能的で小型化された人間の臓器です

プロトコル

1.設計と製造

1. デバイス設計
   1. マイクロ流体デバイスの製造では、Siウェーハ上にスピンコートされた200μmのSU-8層(RCA-1洗浄、2%フッ化水素(HF)処理)を使用してSU-8モールドを作成し、その後^{、前述のように}シングルマスクフォトリソグラフィステップを実行します^8,9。
   2. SU-8金型から厚さ4mmのポリジメチルシロキサン(PDMS)レプリカを鋳造し、下流の製造ステップ用の耐久性のあるポリウレタン金型を生成します。^{8、9、10、11、12、13、14、15}のさまざまな設計反復を使用できます。
   3. 現在のイテレーションでは、マイクロ流体デバイスを標準の96ウェルプレートフォー....

ディスカッション

体内のほぼすべての組織が血管系を通じて栄養素と酸素を受け取るため、in vitroでの現実的な疾患モデリングと薬物スクリーニングに不可欠な要素となっています。さらに、いくつかの悪性腫瘍と病態は、血管内皮機能障害と透過性亢進によって定義されます³。特に、がんでは、腫瘍関連の血管系はしばしば灌流が悪く、破壊され、漏出しているため、腫瘍への治療?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates	Greiner Bio-One	655096
Methanol ≥99.8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS membrane	PAX Industries	HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator	Bel-Art	F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope	Agilent	CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells	StemBioSys	N/A
Collagen I, rat tail	Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectin human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (Electrophoresis),	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003