単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダ ニオ・レリオ の神経毒性評価

要約

ここでは、ゼブラフィッシュの成魚に対する化学物質(メタンフェタミンやグリホサートなど)の潜在的な神経毒性効果を1つの水槽で効果的に判定するために、新しい水槽、ショーリング、社会的選好試験など、包括的な行動試験バッテリーを紹介します。この方法は、神経毒性および環境研究に関連しています。

要約

神経病理学的影響の存在は、長年にわたり、化学物質の神経毒性を評価するための主要なエンドポイントであることが証明されました。しかし、過去50年間、モデル種の行動に対する化学物質の影響が活発に調査されてきました。次第に、行動エンドポイントが神経毒性学的スクリーニングプロトコルに組み込まれ、これらの機能的結果は現在、化学物質の潜在的な神経毒性を特定および決定するために日常的に使用されています。成体のゼブラフィッシュの行動アッセイは、不安、社会的相互作用、学習、記憶、依存症など、幅広い行動を研究するための標準化された信頼性の高い手段を提供します。成魚のゼブラフィッシュの行動アッセイでは、通常、実験場に魚を置き、ビデオ追跡ソフトウェアを使用してその行動を記録および分析します。魚はさまざまな刺激にさらされ、その行動はさまざまな指標を使用して定量化できます。新しい水槽試験は、魚の不安様行動を研究するために最も受け入れられ、広く使用されている試験の1つです。群れと社会的選好のテストは、ゼブラフィッシュの社会的行動を研究するのに役立ちます。このアッセイは、群れ全体の挙動が研究されているので、特に興味深いものです。これらのアッセイは、再現性が高く、薬理学的および遺伝子操作に対して感度が高いことが証明されており、行動の根底にある神経回路と分子メカニズムを研究するための貴重なツールとなっています。さらに、これらのアッセイは、行動の潜在的な調節因子である可能性のある化合物を特定するための薬物スクリーニングに使用できます。

本研究では、魚類の神経毒性学における行動ツールの適用方法を示し、娯楽用薬物であるメタンフェタミンと環境汚染物質であるグリホサートの効果を分析します。この結果は、ゼブラフィッシュの成体における行動アッセイが、環境汚染物質や薬物の神経毒性学的影響の理解に大きく貢献していることを実証するとともに、神経機能を変化させる可能性のある分子機構に関する手掛かりも得ている。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、生態毒性学、創薬、安全性薬理学の研究で人気のあるモデル脊椎動物種です。ゼブラフィッシュは、低コストで分子遺伝学的ツールが確立されており、神経系の形態形成と維持に関与する主要な生理学的プロセスの保存により、神経行動毒性学を含む神経科学研究に理想的な動物モデルとなっています^1,2。化学物質の神経毒性を評価するための主な評価項目は、最近まで、神経病理学的影響の存在でした。しかし、最近では、行動エンドポイントが神経毒性学的スクリーニングプロトコルに組み込まれており、これらの機能的結果は、化学物質の潜在的な神経毒性を特定および決定するために一般的に使用されています^3,4。さらに、行動エンドポイントは生態学的観点から非常に関連性が高く、魚の非常に穏やかな行動変化でさえ、自然条件での動物の生存を危険にさらす可能性があります⁵。

ゼブラフィッシュの成体研究で最もよく使われる行動アッセイの1つに、不安^{様行動を測定する}新しい水槽試験(NTT)があります^6,7

プロトコル

倫理基準を厳格に遵守することで、実験に使用されたゼブラフィッシュの福祉と適切な処理が保証されます。すべての実験手順は、動物実験委員会(CID-CSIC)によって確立されたガイドラインに基づいて実施されました。以下に示すプロトコルと結果は、地方自治体から付与されたライセンス(契約番号11336)に基づいて実施されました。

1.行動実験用動物飼育施設

1. 10:00から17:00の間に27〜28°Cの隔離された行動室ですべてのテスト( 図1に表示)を実行します。
2. 実験開始前に、対照魚とばく露魚の両方をきれいな魚水(90 mg/L水槽系塩、0.58 mM CaSO₄·2H₂O、および0.59 mM NaHCO₃を含む逆浸透精製水)で数回洗浄し、実験水槽の汚染の可能性を回避します。
3. 実験開始の1時間前に動物を行動室に慣らします。
4. 動物(≈50:50、雄:雌の比率)が実験的にナイーブであることを確認し、実験群に気づかない観察者とともに、すべての行動テストを盲目的に実施します。
5. 行動アッセイで有意義な結果を得るには、条件ごとに合計18人の被験者(n = 18)を用意し、理想的には2つ以上の独立した実験の間に取得します。たとえば、個々のテ....

ディスカッション

NTTで観察された特徴的な不安行動は、脳で分析されたセロトニンレベルと正の相関がありました²¹。例えば、5-HT生合成の阻害剤であるパラクロロフェニルアラニン(PCPA)に曝露した後、魚は陽性のジオタキシシスと脳の5-HTレベルの低下を示し²²、METHで得られた結果と非常によく似た結果を示しました。したがって、METHに曝露されたゼブラフィッシュにおけ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquarium Cube shape	Blau Aquaristic	7782025	Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software	Noldus	Ethovision XT	Version 12.0 or newer
GigE camera	Imaging Development Systems	UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02	GraphPad software Inc	GraphPad Prism 9.02	For Windows
IDS camera manager	Imaging Development Systems
LED backlight illumination	Quirumed	GP-G2
SPSS Software	IBM	IBM SPSS v26
uEye Cockpit software	Imaging Development Systems	version 4.90