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  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

このプロトコルは、レトロウイルスベクターの生産とマウスT細胞の形質導入を合理化し、マウスCAR-T細胞の効率的な生成を促進します。

要約

キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞を用いた改変細胞治療は、血液悪性腫瘍患者に対して目覚ましい効果を発揮し、現在、多様な固形腫瘍の治療のために開発が進められています。これまでのところ、新規CAR-T細胞産物の予備評価は、主に免疫不全マウスを用いた異種移植腫瘍モデルで行われてきた。このアプローチは、実験環境でヒトCAR-T細胞の生着を成功させるために選択されます。しかし、腫瘍とCAR-T細胞が同じマウス株に由来する同系マウスモデルでは、機能的な免疫系と包括的な腫瘍微小環境(TME)の文脈で新しいCAR技術を評価することができます。ここで説明するプロトコルは、レトロウイルス形質導入と ex vivo T細胞培養のための標準化された方法を提示することにより、マウスCAR-T細胞生成のプロセスを合理化することを目的としています。このプロトコルに記載されている方法は、この研究で使用されたもの以外の他のCARコンストラクトに適用して、免疫コンピテントシステムにおける新しいCARテクノロジーのルーチン評価を可能にします。

概要

キメラ抗原受容体(CAR)を発現する養子T細胞療法は、適応免疫系の力を利用して抗原陽性がん細胞を特異的に標的化して排除することにより、がん免疫療法の分野に革命をもたらしました1。B細胞悪性腫瘍を標的とするCAR-T細胞療法の成功は臨床的に検証されていますが、固形腫瘍を標的とする新しいCARの開発には、動物モデルで実施される前臨床試験が依然として不可欠です。しかし、これまでの固形腫瘍の適応症では臨床効果は限定的であり、個々の前臨床モデルでは生体医薬品の薬力学や臨床効果を正確に予測できないことがますます明らかになっています2,3。したがって、研究者らは、CAR-T細胞製品の前臨床試験を拡大し始めており、ヒトおよびマウスがんの異種移植モデルおよび同系モデルにおける並行評価をそれぞれ含めています。

ヒト腫瘍とT細胞を免疫不全マウスに生着させる異種移植モデルとは異なり、同系モデルでは、機能的な免疫系の文脈でCAR-T細胞応答を調べることができます。具体的には、同系腫瘍を有する免疫能力のあるマウスは、養子移植されたT細胞と、腫瘍微小環境(TME)におけるT細胞機能を抑制することが知られている腫瘍関連マクロファージ(TAM)および制御性T細胞(Treg)を含む状況特異的環境との間の相互作用を研究するシステムを提供します4,5,6.さらに、同系モデルは、オンターゲット、オフ腫瘍毒性、およびサイトカイン放出症候群などの追加の毒性につながる可能性のある宿主因子とのCAR-T細胞相互作用を評価するための追加のプラットフォームを提供します7。

これらの利点にもかかわらず、同系CAR-T細胞研究の数は依然として限られています。特に、同系モデルでは、同じマウス株由来のCAR-T細胞の自家工学が必要であり、効率的なマウスT細胞の形質導入とex vivo増殖のための方法論がないため、さらなる課題となっています2,8。このプロトコルはretroviralベクトルおよび最大限に活用されたT細胞のtransductionの生産によって安定したCARの表現を達成する方法を概説する。プロセス全体の概略図を図1に示します。このアプローチの使用は、マウスCAR-T細胞の効率的なレトロウイルス形質導入と、超遠心分離によるウイルス濃度を必要とせずに高いCAR発現を達成することを実証しています。CARコンストラクトの抗原特異性を変化させる戦略は、追加の導入遺伝子の共発現に加えて議論されています。

プロトコル

すべての動物処置は、体重20〜25gの6〜8週齢の雌のBALB / cまたはCF57BL / 6マウスを使用して、施設動物管理および使用委員会(コロンビア大学、プロトコルAC-AABQ5551およびAC-AAAZ4470)から承認を得て実施されました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。このプロトコルはマウスT細胞の「活性化後の日数」のまわりで構成され、ウイルスの生産は日-2に始まる。レトロウイルスは、最初の産生後-80°Cで保存することができ、このプロトコルを将来使用するために、0日目にステップ2のT細胞の単離と活性化を開始することができます。

1. レトロウイルスベクターの作製

注:ウイルス産物は、パッケージング遺伝子を2つの別々のプラスミドに分離することにより複製欠陥があり( 材料表を参照)、組換えイベントの可能性や複製能力のあるウイルスの不注意な産生を大幅に低減します。

  1. トランスフェクションの1日前にPhoenix Eco細胞を調製します(2日目の手順)。
    1. 30 mLの培地(Phoenix Eco培地、表1に詳述)を使用して、15 cmのTC処理プレートまたはT150培養フラスコに約1 x 107細胞を播種します。
    2. 37°Cで一晩インキュベートします。 18〜24時間後、細胞は約70%コンフルエントで均一に分布し、増殖することなく高いウイルス収量を確保する必要があります。
      注:最適な結果を得るには、継代の少ない細胞を使用し、ウイルス産生のためにプレーティングする前日に継代します。ルーチン培養中にPhoenix Eco細胞が過剰に増殖しないようにしてください。
  2. リポフェクションおよびエンハンサー試薬、pCL-Eco(Gag/Pol)、およびpMSCV発現プラスミド(pMSCV_PGK_mGFP28z)を含むトランスフェクションミックスを、還元血清培地( 材料表を参照)で調製します(Day -1手順)。
    注:コトランスフェクションは、pMSCVとpCL-Ecoの1:1の比率で実施する必要があります。
    1. チューブAの調製:トランスフェクション試薬105 μLを15 cmプレートあたり3.75 mLの還元血清培地で希釈し、ボルテックスまたはピペッティングで上下させて完全に混合します。
    2. チューブBを調製:pMSCV発現プラスミド(21 μg)およびpCL-Eco(21 μg)を90 μLのエンハンサー試薬とともに希釈し、15 cmプレートあたり3.75 mLの還元血清培地に浸します。ピペッティングで上下させてよく混ぜます。
      注:複数のウイルス産物を生成する場合は、pCL-Ecoとエンハンサー試薬を含むマスターミックスをセットアップしてください。
    3. チューブAをチューブBに加え、ピペッティングで十分に混合します。室温で10〜20分間インキュベートすると、総容量は約7.5 mLになります。
    4. Phoenix Ecoプレートから10 mLの細胞培養培地を慎重に取り出し、プレートを傾けてピペッティングし、滴下してトランスフェクションミックスの全容量を残りの培地に加えます。細胞を37°Cのインキュベーターに戻します。
  3. トランスフェクションの16〜20時間後にトランスフェクションしたPhoenix Eco細胞の培地を交換します(0日目の手順)。
    1. 水浴またはビーズ浴を使用して、血清およびβ-メルカプトエタノール(2-ME、 材料表を参照)を含まないマウスT細胞培地(mTCMウイルス採取、 表1に記載)を37°Cに予熱します。
    2. 可能であれば真空を使用して、プレートを傾け、ピペットチップを下隅に置いて、Phoenix Eco培地を慎重に取り除きます。細胞を過度に乾燥させないでください。
    3. 加温したmTCMウイルス回収培地を、最も遅い設定で30 mLをピペッティングして、傾斜したプレートの側面に静かに加えます。細胞を37°Cのインキュベーターに戻します。
      注:このステップにより、Phoenix Eco細胞がプレートから剥離し、ウイルス力価が低下する可能性があります。あらかじめ温められた培地と穏やかなピペッティングにより、中断を最小限に抑えることができます。
  4. トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を回収します(1日目の手順)。
    1. ウイルス上清を回収し、0.45 μmのPVDFフィルター( 材料表を参照)でろ過して、細胞や破片を除去します。ウイルスを分注して-80°Cで凍結するか、フレッシュウイルスを使用する場合はステップ3の1日目に直接進んでください。
    2. 前述のように、ウイルス力価(形質導入単位/mL)をフローサイトメトリーで決定します9。この手順は省略可能です。
      1. レトロネクチン(材料表を参照)でプレコートし、最終容量100 μLのmTCMウイルス採取培地にレトロウイルス上清の3倍段階希釈液をロードした非組織培養(TC)処理96ウェルプレート中で、1 x 10 5活性化マウスT細胞を小規模形質導入することにより、ウイルス力価を測定します。
        注:T細胞の単離、活性化、形質導入に関する詳細な手順については、以下のステップ2およびステップ3を参照してください。
      2. 形質導入後4〜5日でCAR表面発現をフローサイトメトリーで決定します。
      3. 式10に従ってウイルス力価を計算します:(N x F x D)/V(Nは形質導入された細胞の数、FはCAR陽性細胞の頻度、Dは希釈係数、Vは形質導入量(mL)で、形質導入単位(TU)/mLを取得します。
        注:ウイルス力価は凍結/融解時に低下する可能性があります。したがって、ウイルス力価は、凍結およびその後融解されたウイルスで理想的に決定されます。

2. マウスT細胞の単離

  1. マウスT細胞を単離して活性化します(0日目の手順)。
    注意: これらのステップは、室温(RT)または4°Cで実行でき、無菌環境で実行する必要があります。
    1. 前述のように 、目的のマウス株(例:Balb/c、C57BL/6)から脾臓を採取し、機械的解離により単一細胞懸濁液を得る。
    2. 滅菌シリンジの裏側を使用して、70〜100μmのセルストレーナーを介して脾臓を50mLのコニカルチューブに押しつぶします。
    3. シリンジを脇に置いた後、5 mLのT細胞分離バッファー(リン酸緩衝生理食塩水、PBS、2%ウシ胎児血清、FBS)でストレーナーを洗浄します。
    4. マッシングステップを繰り返し、5 mLのT細胞分離バッファーでストレーナーをもう一度洗浄します。最終容量を T 細胞単離バッファーで 50 mL にします。
    5. 手動血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、1:20の比率で希釈し、トリパンブルーと1:1で混合することにより、生細胞をカウントします。
    6. 450 x g、4°C(または室温)で10分間遠心分離して細胞をペレット化し、推奨されるT細胞分離キットを使用する場合は、1 x 108/mLで脾細胞を再懸濁します( 材料表を参照)。
      注:この段階で脾細胞を40〜70μmのストレーナーで再ひずみし、凝集塊を除去することができます。
  2. メーカーの指示に従ってネガティブセレクションによりCD3+ T細胞を単離します( 材料表を参照)。磁気分離後、単離液を 15 mL コニカルチューブに移し、最終的な生細胞計数を行います。
  3. 単離したT細胞を450 x g、4°C(または室温)で10分間遠心分離してペレット化し、mTCM活性化培地に1 x 106/mLで再懸濁します(表1)。
  4. マウス抗CD3/抗CD28モノクローナル抗体被覆磁気ビーズ( 材料表参照)を、25 μL/1 x10 6 T細胞と100 U/mLのIL-2の比率で添加してT細胞を活性化します。
  5. 細胞を37°Cのインキュベーターに入れ、一晩放置します。
    注:T細胞のサイズが小さいため、1:10〜1:20の比率で希釈し、血球計算盤を使用して手動でカウントするためにトリパンブルーと1:1で混合することにより、より正確な生T細胞数を達成できます。純度は、細胞を蛍光標識αCD3抗体で染色することにより、フローサイトメトリーによって決定できます。各脾臓は、マウスの年齢と株に応じて、7〜10 x 106 T 細胞を産生します。

3. マウスT細胞形質導入

  1. 形質導入用のプレートを準備します(0日目の手順)。
    1. 未処理の滅菌24ウェルプレートを0.5 mLのヒトフィブロネクチン形質導入促進剤試薬( 材料表を参照)で滅菌PBSで希釈して最終濃度20〜40 μg/mLにプレコートし、4°Cで一晩保存します。
      注:このステップは、未処理の24ウェルプレートを形質導入試薬でコーティングし、室温で2時間インキュベートすることにより、1日目に実行することもできます。
  2. T細胞形質導入を行います(1日目の手順)。
    1. 形質導入のためにプレコートプレートを準備します。プレコートした 24 ウェルプレートの各ウェルから形質導入試薬を取り出し、等量の滅菌ろ過済み PBS + 2% ウシ血清アルブミン(BSA)(0.5 mL)で室温で 30 分間ブロックします。
    2. 0.5〜1mLのPBSで1回洗浄します。
  3. ステップ1のニートレトロウイルス0.5〜1 mLを、またはウイルス力価に基づいて希釈したものを、プレコートされた各ウェルに加え、2,000 x g および32°Cで90分間遠心分離します。
  4. 1 mLの活性化T細胞を各ウイルス負荷ウェルに加え、450 x g 、32°Cで10分間遠心分離します。 細胞を37°Cのインキュベーターに一晩戻します。
  5. 形質導入後24時間で、1〜1.5 mLの細胞培養培地を除去し、1〜1.5 mLのmTCM完全および10 ng/mLの組換えヒトIL-7およびIL-15と交換します( 材料表を参照)。細胞を37°Cのインキュベーターに戻します(2日目の手順)。
    注: ex vivo 培養中は、48時間ごとに10 ng/mLのサイトカインを培養に添加し、T細胞を1 x 106/mLを超えて希釈しないでください。
  6. 形質導入の48時間後、細胞を形質導入プレートから新しい24ウェルまたは6ウェルプレートに移し、細胞を37°Cのインキュベーターに戻します(3日目の手順)。
    注:T細胞の生存率は、開始T細胞の生存率とウイルス力価に応じて、形質導入後24時間から2日に細胞を移植することで改善する可能性があります。
  7. T細胞を脱ビーズし、CAR発現を確認します(5〜6日目の手順)。
    1. 細胞を完全に再懸濁して、αCD3/CD28でコーティングされたビーズから活性化T細胞を解離させ( 材料表を参照)、細胞懸濁液を磁石上に30秒間置きます。細胞懸濁液を目的の ex vivo 培養容器に移し、37°Cのインキュベーターに戻します。
      注:T細胞は、培養フラスコまたはディープウェル培養プレートで培養できます。6ウェルフォーマットプレートのディープウェルで、ウェルあたり30 mLのmTCM完全培地に最低5 x 106 T細胞を播種することが推奨されます( 材料表を参照)。
    2. フローサイトメトリーによるCAR発現の決定8.
      注:GFP-CARの発現は、100 ng/mLの精製GFPとのインキュベーションにより決定しました。N末端エピトープタグを組み込むことで、代替CARコンストラクトの検出が容易になります。
  8. CAR-T細胞の ex vivo 培養を行います(7〜10日目の手順)。
    1. ex vivo培養中は、培地の50%を除去し、48時間ごとに新鮮なmTCMコンプリート+2x 10 ng/mLのIL-7およびIL-15と交換して細胞を維持します。
      注:マウスCAR-T細胞は、活性化後7日で下流アプリケーションに使用できる状態になりますが、融解後の生存率が低いため、凍結保存しないでください。

結果

ここに記述されているプロトコルはマウスCAR-Tのセルの生成のためのマウスT細胞のtransductionのプロセスを標準化することを向ける。 図 1 は、関連する手順の詳細な説明を示しています。このプロセスは、ウイルス成分をPhoenix Eco細胞に同時トランスフェクション することにより、 レトロウイルスベクターを製造することから始まります。 図 2

ディスカッション

このプロトコルは生体 内の 調査のためのCAR-Tのセルを発生させるためにマウスT細胞のretroviralのtransductionに必要なステップおよび試薬を記述する。レトロウイルスの形質導入条件を最適化することで、超遠心分離や追加の試薬によるウイルス濃縮を必要とせずに、堅牢なCAR発現を実現します。ただし、この手法に適用できる変更は複数あります。

このプロトコル?...

開示事項

利益相反の宣言はありません。

謝辞

原稿の批判的レビューをしてくれたL.Brockmannに感謝します。この研究は、NIH 1R01EB030352およびUL1 TR001873によってサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filtersMilliporeSigmaSLHVR33RS
1 mL syringe Fisher Scientific 14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-135
10 mL syringe BD14-823-16E
100 μm strainerCorning07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishesThermoFisher Scientific 130183
15 mL conical tubes Falcon14-959-70C
40 μm strainer Corning07-201-430
50 mL conical tubes Falcon14-959-49A
70 μm strainerCorning07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old Jackson Laboratory651
B-Mercaptoethanol Gibco21985023
Bovine Serum Albumin GOLDBIOA-420-500
DMEM MediumGibco11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium Gibco14-190-250
DynaMag-2 Magnet Invitrogen12-321-D
EasySep Magnet Stemcell Technologies18000
EasySep Mouse T cell Isolation KitStemcell Technologies19851
FACS buffer BDBDB554657
Fetal bovine serum (FBS) CorningMT35011CV
GlutaMAXGibco35-050-061
G-Rex6Wilson Wolf80240M 
HEPES Buffer Solution Gibco15-630-080
Human recombinant IL-15 Miltenyi Biotec130-095-765
Human recombinant IL-2Miltenyi Biotec130-097-748
Human recombinant IL-7Miltenyi Biotec130-095-363
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421Biolegend100228
Mouse Anti-CD3/CD28 DynabeadsGibco11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605BD563151
Mouse Anti-CD44 APC Biolegend103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7TonboSKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7TonboSKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera Nikon
Non-treated 24 well plates CytoOneCC7672-7524
Opti-MEMGibco31-985-062
pCL-EcoAddgene#12371
Penicillin/Streptomycin SolutionGibco15-070-063
Phoenix Eco cellsATCCCRL-3214
pMDG.2Addgene#12259
pMSCV_PGK_GFP28zN/AProduced by R.LV.
Purified sfGFPN/AProduced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')Takara BioT100B
RPMI 1640Gibco21875
Serological pipette 10 mLFisher Scientific 13-678-11E
Serological pipette 25 mLFisher Scientific 13-678-11
Serological pipette 5 mLFisher Scientific 13-678-11D
Sodium PyruvateGibco11-360-070
TC-treated 24 well plates Corning08-772-1
Trypan blue Gibco15-250-061

参考文献

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