生体細胞の機械的疲労を評価するための振幅変調電極形成

要約

ここでは、振幅変調電極形成アプローチを使用したヒト赤血球の場合の機械的疲労試験のプロトコルを示します。この一般的なアプローチは、周期的変形からの懸濁液中の生物学的細胞の形態学的および生体力学的特性の系統的変化を測定するために使用することができる。

要約

赤血球(RBC)は、その顕著な変形能力で知られています。それらは微小循環を通過するときに繰り返しかなりの変形を受ける。変形能の低下は、生理学的に老化した赤血球で見られます。 細胞の変形能を測定する既存の技術は、周期的な負荷によって引き起こされる細胞膜の段階的な劣化である疲労の測定に容易に使用することはできません。マイクロ流体チャネルにおける振幅シフトキーイング(ASK)変調ベースの電極形成を使用して、周期的せん断応力による赤血球の機械的劣化を評価するためのプロトコルを提示します。簡単に説明すると、マイクロ流体チャネル内のインタージテッド電極は、信号発生器を使用して無線周波数で低電圧交流で励起される。浮遊中の赤血球は電界に反応し、細胞を電極の端に移動する正の誘電泳動(DEP)を示します。次に、2つのセルの半分にかかる電気力によりセルが引き伸ばされ、電着として知られる一軸延伸が発生します。せん断応力のレベルと結果として生じる変形は、励起波の振幅を変更することで簡単に調整できます。これにより、大小の変形に応じた赤血球の非線形変形能を高スループットで定量化できます。ASK法で励起波を変更すると、プログラム可能な負荷率と周波数で周期的な電極形成が誘導されます。これは、RBC疲労の特性評価に便利な方法を提供します。当社のASK変調電極形成アプローチにより、初めて、繰返し荷重からのRBC疲労の直接測定が可能になりました。一般的な生体力学的試験、他の細胞型や疾患状態における細胞の変形能や疲労の分析のためのツールとして使用でき、酸素圧や生物学的および化学的手がかりなどの細胞の微小環境を制御するための戦略と組み合わせることもできます。

概要

赤血球(RBC)は、人体で最も変形しやすい細胞です¹。それらの変形能力はそれらの酸素運搬機能に直接関係している。赤血球の変形能の低下は、いくつかの赤血球障害の病因と相関することがわかっています²。変形能の測定により、赤血球関連疾患の理解が深まりました³。赤血球の通常の寿命は、70^〜140日目4までさまざまです。したがって、それらの変形能力が時効プロセスとともにどのように低下するか、例えば、周期せん断応力^による疲労挙動を測定することが重要です3。

ハイスループットでの赤血球変形能の測定は、個々の細胞にピコニュートンスケール力(~^10-12 N)がかかるため、困難です。過去10年間で、細胞の変形能を測定するために多くの技術が開発されてきました⁵。単一細胞レベルでの赤血球の変形測定はピペット吸引と光ピンセットで、バルク分析は浸透圧勾配エクタサイトメトリーで行うことができます。エクタサイトメトリー分析は豊富なデータを提供し、血液疾患を診断する機会を提供します^6,7。赤血球の変形能は、コロイドプローブ原子間力顕微鏡による粘弾性理論を用いて解析することもできる。この方法では、計算解析を適用して、時間依存応答と定常応答の両方を考慮して、赤血球の弾性率を推定します。個々の赤血球の変形能は、シングルセルマイクロチャンバーアレイ法を用いて測定することができる。この方法は、膜および細胞質蛍光マーカーを介して各細胞を分析し、^{血液疾患を検出する}ための複雑な赤血球集団における赤血球変形能および細胞特性の分布に関する情報を提供します8。

疲労は、工学材料および生体材料の特性の低下における重要な要因です。疲労試験により、繰返し荷重を受ける構造の完全性と寿命の定量的分析が可能になります。生体細胞における疲労の分析は、細胞膜における周期的変形の実施のための一般的で、容易に適用可能な、高スループットおよび定量的方法の欠如によって長い間妨げられてきた。これは、マイクロ流体設定で実装された電気信号変調および電気形成技術を利用することで可能になります。デジタル変調としての振幅シフトキーイング(ASK)技術は、この記事ではオンオフキーイング(OOK)変調を介して適用されます。キーイングの概念は、チャネルを介したデジタル信号の送信を指し、機能するには正弦波搬送波信号が必要です⁹。オン時間とオフ時間を等しく設定できます。ONキーイングでは、赤血球は不均一な電界によって生じる外部電化力(F_dep)¹⁰ にさらされながら変形状態になります。オフ キーイングでは、RBC はリラックス状態になります。RBCの疲労、すなわち負荷サイクルの増加に伴う伸び能力の漸進的な低下を観察します。赤血球の疲労による変形能の喪失は、血液循環中に蓄積された膜損傷に関する洞察を提供し、細胞疲労と病態との関係をさらに調査することを可能にします。

ここでは、ASK変調電極形成を介して赤血球の疲労試験がマイクロ流体デバイスにどのように実装されるか、および赤血球の機械的変形能の段階的な劣化の特性評価のためのマイクロ流体デバイス、機械的負荷、顕微鏡的想像などのシステム設定について段階的に説明します。

プロトコル

非同定化されたヒト全血が商業的に得られた。血液サンプルを含む作業は、フロリダアトランティック大学の機関バイオセーフティ委員会によって承認されたプロトコルを利用して、バイオセーフティレベル2の実験室で実施されました。

1. マイクロ流体デバイスの作製

1. マイクロ流体チャネル設計用のSU-8マスターシリコンウェーハをプラスチック製の14cmペトリ皿の内側にテープで留め、N₂ ガスで洗浄します。
2. 紙コップにポリジメチルシロキサン(PDMS)ベース60gとPDMS硬化剤6gの重量を量ります。混合物が曇った白色になるまで、木のへらを使用して2つの部分を混合します。
3. PDMS混合物をシリコンウェーハを含むプラスチックペトリ皿に注ぎます。ペトリ皿を3方向活栓付きの真空デシケーターに入れます。活栓のバルブを回して真空をデシケータ室に接続し、PDMSから気泡を取り除きます。
4. 約5分サイクルでデシケーターチャンバーを周囲に接続するように活栓バルブを調整して、デシケーターチャンバーに空気を再導入します。すべての気泡がチャネルの機能から除去されるまで繰り返します。
5. ペトリ皿を70°Cのオーブンに4時間入れます。時間が経過したら、ペトリ皿を取り出し、室温まで冷まして、カッティングマットの上に置きます。
6. メスを使用して、シリコンウェーハの上のPDMSの部分を切り取ります。2枚のラボラッピングフィルムの間に切り抜きPDMSを置きます。マイクロチャネルのくぼみと半透明フィルムとの間に形成されるギャップは、マイクロ流体チャネルの位置、ならびにそのそれぞれの入口および出口の識別を容易にする。
7. かみそりの刃を使用して、大きなPDMSから個々のチャネルを切り取ります。2つのサイズごとに生検パンチを使用して、3mmの入口穴と1.5mmの出口穴を開けます(図1A)。
8. 穴あけチャネルを、チャネル側を上に向けて、きれいなスライドガラスの上に置きます。薄膜酸化インジウムスズ(ITO)を挟んだ電極を含む20 mm x 15 mmのガラス基板を、電極を上に向けて同じスライドガラス上に置きます。
9. PDMSと基板を入れたスライドガラスをプラズマクリーナーにそっと入れます。ガスバルブを閉じ、ポンプスイッチをオンにし、2分間待って、600〜800mTorrのセンサー読み取り値を取得します。
10. 電源スイッチをONにして、30秒待ちます。RF電源ノブを低から高に回し、1分間待ちます。
11. 次に、RFノブをローに、電源スイッチをオフに、ポンプスイッチをオフに回し、ガスバルブを開いて、シーケンスを逆にします。
12. プラズマクリーナーのチャンバーを開けた直後に、PDMSを持ち上げて、チャネル側が下を向くように回転させます(180°)。ITO基板の上部にチャネルを配置します。ボンディングプロセスが始まりました。
13. ピンセットを使用して、PDMSの角を約3秒間ゆっくりと押し下げます。チャンネル自体を押さないでください。
    注意: 接着プロセスは、2つの処理された表面が物理的に接触すると自然に発生します。
14. プライミング媒体を23 Gの針で1 mLのシリンジに入れます。針を入口ウェルにまっすぐに挿入してから媒体を解放して、チャネルを慎重に濡らします。ゆっくりと操作してください。気泡を入れないでください。少なくとも3分間インキュベートします。
15. 10 μLのピペットチップを使用してプライム培地を除去します。DEP媒体をチャネルに挿入して、DEP媒体でチャネルを3回洗浄します。チャンネルは常に濡れたままにしてください。

2.テストフィクスチャ

注:テストフィクスチャは3D CADソフトウェアを使用して設計されており、ベースハウジングユニットとトップユニットが含まれています(図1B)。次に、試験治具の標準公差限界が約3±0.005インチの寸法を有する3軸CNCフライス盤を使用して製造され、電子ノギス(図示せず)を使用してチェックされる。治具の無菌性は、in vitro生体力学的試験には必要ありません。

1. 2セットのスプリングピストンコネクタのはんだカップの端に事前にはんだ付けワイヤを差し込みます。
2. スプリングピストンコネクタをトップユニットに挿入し、エポキシ接着剤を一滴加えて恒久的な接着を作成します。

3. 電着処理バッファーの作製

1. DEP培地を調製するには、スケールを使用して12.75 gのスクロースと0.45 gのデキストロースを計量します。
2. 両方の粉末を、150 mLの脱イオン(DI)水と3.5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)とともに1つの容器に溶解します。
3. 低範囲導電率試験機を使用して導電率を測定し、0.04 S/mであることを確認します(図2)。
   注: 異なる導電率値を使用すると、結果として生じる DEP 力¹¹ の符号と大きさが変わる可能性があります。ただし、電着には正のDEP力が必要です。
4. 浸透圧計を使用して、浸透圧が血漿の正常範囲内、275〜295 mOsm / kgの水内にあることを確認します(図3)。4°Cで保存してください。これでDEP培地が調製されました。
5. 15 mLチューブに、0.5 gのウシ血清アルブミン(BSA)を10 mLのDEP培地に溶解します。よく混ぜます。これで、デバイスのプライムメディアが準備されました。

4.細胞懸濁液の調製

1. 血液を1 mLのPBSで268 x g で3分間遠心分離することにより、全血20 μLを洗浄します。上清を捨てる。
2. 赤血球を1 mLのPBSに再懸濁します。静かにピペットで混ぜます。赤血球を268 x g で3分間洗浄し、上清を廃棄します。
3. 10 μLのマイクロピペットチップを使用して5 μLの赤血球ペレットを抽出し、1 mLのDEP培地に完全に分注します。268 x g で3分間遠心分離して細胞を洗浄します。
4. 上清を廃棄し、赤血球を1 mLのDEP培地に再懸濁します。静かにピペットで混ぜます。
5. 赤血球を268 x g で3分間洗浄し、上清を廃棄します。2 μLの赤血球ペレットを500 μLのDEP培地にピペットで入れます。細胞懸濁液は、62〜104細胞/μL¹²の範囲の濃度で調製され、標準的な細胞計数スライドを使用して確認することができる。

5. 電着セットアップと疲労試験

1. マイクロ流体デバイスをテストフィクスチャの下部に配置します。固定具の上部をデバイスに合わせ、2組のナイロンネジとナットを使用して2つの部品を組み立てます(図4)。
2. 試験治具を顕微鏡ステージに置きます。顕微鏡下で目的の電極セットを1つ見つけます。
3. 配置された電極セットに一致する対応する電極線のペアを関数発生器の出力端子に接続します(図4)。
4. マイクロ流体チャネルの3 mm注入口から5 μLのDEP培地を除去します。10 μLのピペットチップを使用して、5 μLの細胞懸濁液をインレットにゆっくりとロードします。
5. 細胞を1分間落ち着かせます。必要に応じて、DEP培地をインレットに追加して、細胞をチャネルに押し込みます。
6. 20倍の倍率でチャンネルを観察します。414/46 nmバンドパスフィルターを使用して、イメージングのコントラストを高めます。
7. サインボタンを押して、3MHzの周波数で2V_RMS振幅の正弦波を定義します。Modボタンを押してモジュレーションを有効にします。[タイプ]オプションを押して、ウェーブモードをASKに変更します。
8. 変調周波数を250mHzに設定し、これは4秒のロード/アンロード期間に対応します(図5A)。関数発生器の出力をONにします。
9. 10分ごとに30フレーム/秒(fps)で1分のビデオを録画します。

6. 赤血球変形のキャラクタリゼーション

1. ビデオ編集アプリケーションを使用して、 Ctrl + Oを押して、前の手順で記録した.aviファイルを開きます。タイムラインを使用して対象のフレームを選択し、キーボードの Home キーを押してから End キーを押して、選択範囲の開始フレームと終了フレームを同一に設定します。
2. 画像フレームをエクスポートします。出力形式を JPEG に選択し、[ OK]を押します。
3. ImageJアプリケーションを開き、前の手順で保存した画像を読み込みます。まず、[ 解析]>[計測値の設定 ]を押して必要な計測値を設定し、[ 面積]、[周長]、 および [楕円の適合 ]のチェックボックスがオンになっていることを確認します。 OKを押します。
4. 次に、[ 画像>タイプ]>[8ビット]を選択して、画像をグレースケールに変換します。
5. 次に、 画像>調整>しきい値を使用して画像をバイナリに変換します。[しきい値] ダイアログ ボックスで、必要に応じて 2 つのスライダーを調整します。 [適用 ] をクリックし、[しきい値] ダイアログ ボックスを閉じます。
6. [ >ツールの分析] > [ROI マネージャー] を選択します。ROIマネージャで、[ すべて表示]というラベルの付いたチェックボックスを押します。このボックスは閉じないでください。
7. ワンド(トレース)ツールを選択し、画像内の該当するセルを選択して、キーボードのTキーを押します。選択したセルに番号が付けられます。新しいセルを再度選択できます。測定する該当するセルをすべて選択します。該当する細胞は、他の細胞から単離されたものとして識別される。これらのセルの数は、1 つの視野で 50 から 200 の範囲になります。
8. [ROI マネージャー] ボックスに戻り、[ 測定] を押します。これにより、[結果] ボックスが開きます。[メジャー] と [マイナー] というラベルの付いた列は、それぞれフィットした楕円の長軸と短軸の長さ (ピクセル単位) です。[ ファイル] > [名前を付けて保存] を選択して、 測定値を CSV 形式のファイルとしてエクスポートします。
9. 適切な計算分析ソフトウェアを使用して、メジャーとマイナーの商を計算します。

結果

細胞懸濁液をマイクロ流体チャネルに装填すると、細胞の比較的均一な分布が観察された。関数発生器からの信号出力(単純な正弦波やASKのオンキーイング位相など)を行うと、薄膜のインターディジット電極は不均一な交流電界を生成しました。浮遊セルはこの電気的励起に自発的に応答し、正のDEP挙動、すなわちより高い電界強度を有する電極の端に向かって移動した。その結果、セルは?...

ディスカッション

DEP力を誘導する正弦波のASK OOK変調を使用して、長期間にわたる赤血球の機械的疲労をテストできます。このプロトコルでは、細胞変形能に対する潜在的な代謝への悪影響を防ぐために、in vitro疲労試験を1時間に制限しました。包括的な疲労試験条件は、ASK変調電極形成技術を使用してプログラムできます。負荷周波数、振幅、負荷率などのパラメータはすべてプログラムできます。荷重周波...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"