マウスラウンド精子細胞注射

要約

ここでは、マウスにラウンド精子細胞注入法(ROSI)を行う方法を紹介します。これは、臨床応用が期待され、胚発生のメカニズムを調べるための有用性を持つ技術です。

要約

一倍体の遺伝的内容を特徴とする丸い精子細胞は、成熟した精子の前駆細胞を表しています。円形精子細胞注射(ROSI)の革新的な技術により、卵子をうまく受精させ、生存可能な胎児に成長させることができます。1995年に達成された画期的なマイルストーンとして、ROSI技術によって最初のマウス胎児が誕生しました。それ以来、ROSIは、胚発生を支配する複雑なメカニズムを解明するための極めて重要なツールとして浮上し、マウス生成の加速や遺伝子改変マウスの作製など、さまざまなアプリケーションで大きな可能性を秘めています。1996年、ROSI技術を通じて最初のヒト胎児が誕生し、大きな節目を迎えました。しかし、この方法の臨床応用では、成功と失敗の変動パターンが示されています。今日まで、ROSIテクノロジーは、主に出生効率が低く、胎児の安全性の検証が不十分であるため、臨床診療で広く適用されていません。この記事では、マウスでROSIを実行する正確な方法の包括的な説明を提供し、基礎研究とその潜在的な臨床応用に新たな光を当てることを目的としています。

概要

精子形成の最終段階は、丸い精子細胞が、明確な頭、首、および細長い尾の構造を特徴とする完全に発達した精子に変換することを含みます¹。この形質転換は、核内のクロマチンの凝縮、ヒストンのプロタミンによる置換、アクロソーム形成、ミトコンドリア鞘の発達、中心小体の移動と損失、尾部構造の形成、細胞残基の除去など、細胞形態の大幅な変化を包含^{しています2。}

1992年、ICSI(Sci^{)技術により}、ヒト初の胎児の誕生に成功しました3。それ以来、研究者たちは、成熟した精子と同じ一倍体の遺伝的組成を共有する円形の精子細胞を利用して、卵子を受精させ、生存可能な妊娠を維持する可能性を探求してきました^2,4。その後、1996年に、丸型精子細胞注入(ROSI)技術によって妊娠した最初のヒト胎児が出産されました^5,6。マウスのICSIとROSIを含む研究は、マウスの卵子膜が注射プロセス中に損傷を受けやすいため、ヒトの研究よりも遅れていたことは注目に値します。この問題....

プロトコル

本実験で使用したB6D2F1(C57BL/6 x DBA/2)、C57BL/6、ICRマウスは、Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd.(中国・北京市)から購入しました。すべての動物治療は、吉林大学第一病院実験動物倫理委員会が承認した実験手順と基準を遵守していました(承認番号:20200435)。

1. 関連試薬の調製

1. いくつかの試薬を商業的に入手し、残りの試薬を自己調製します。
   1. 丸型精子細胞(RS)、精子、卵子のin vitroプロセッシング用の緩衝系であるM₂をサプライヤーから入手してください。
   2. 以前に公開されたプロトコル²⁰に従って、AOA用のCa²⁺フリーC.L. Chatot、C.A. Ziomek、およびB.D. Bavister(CZB)培地を調製します。
   3. 胚培養用のアミノ酸(KSOMaa)溶液を添加したシンプレックスカリウム最適化培地をサプライヤーから入手します。
   4. 0.1 gのヒアルロニダーゼを1 mLの胚水に溶解して、使用濃度0.1%(1 g/L)のヒアルロニダーゼ....

結果

まず、AOAが胚の発生能力に及ぼす影響を調べることから研究を開始しました。実験計画の概略図を 図1Aに示します。精子注入の前に、卵母細胞はAOA(A-ICSI)または未治療(ICSI)のいずれかを受けました。胚発生に関する詳細なデータを 表1に示します。その結果、A-ICSI群とICSI群の間で、卵割率、胚盤胞率、出生率に有意差は認められな?.......

ディスカッション

卵子活性化の補助
ROSIの重要な前提条件は、丸い精子細胞だけでは卵子の活性化を開始できないため、AOAです。現在、マウスで最も確立された方法は塩化ストロンチウムの使用を含みます^23,24、最も進んだヒトへの応用は電気的活性化^13,14を採用しています。卵子が.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl22H2O	Sigma	C7902	Preparation of CZB
Glucose	Sigma	G6152	Preparation of CZB
HEPES-Na (basic)	Sigma	H3784	Preparation of CZB
Hoechst 33342	Beyotime	C1025	FACS
human chorionic gonadotropin (HCG)	Ningbo Second Hormone Company	HCG	Ovulation promoting drugs
Hyaluronidase	Sigma	H3506	Removing granulosa cells around the oocyte
KCl	Sigma	P5405	Preparation of CZB
KH2PO4	Sigma	P5655	Preparation of CZB
KSOMaa	Caisson Labs	IVL04-100ML	Potassium simplex optimized medium supplemented with amino acids
L-glutamine	Sigma	G8540	Preparation of CZB
M2	Sigma	M7167-50ML	Operating fluid
MgSO47H2O	Sigma	M1880	Preparation of CZB
Na2-EDTA2H2O	Sigma	E5134	Preparation of CZB
NaCl	Sigma	S5886	Preparation of CZB
NaHCO3	Sigma	S5761	Preparation of CZB
Na-lactate 60% syrup d = 1.32 g/L	Sigma	L7900	Preparation of CZB
Na-pyruvate	Sigma	P4562	Preparation of CZB
Piezo drill tips (ICSI)	Eppendorf	piezoXpert	Piezoelectric membrane rupture
pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	Ningbo Second Hormone Company	PMSG	Ovulation promoting drugs
PVA	Sigma	P8136	Preparation of CZB