マウス腸におけるT4バクテリオファージと 大腸菌 の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をIn vivoで研究するためのプロトタイプモデル

要約

細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ(ファージ)は、腸内細菌叢の不可欠な構成要素です。これらの共生生物は細菌の適応度と個体群動態を促進しますが、腸の恒常性や疾患にどのような影響を与えるかについてはほとんどわかっていません。このプロトコルは他のバクテリオファージ細菌の組に適応可能なマウス モデル内の隔離されたT4バクテリオファージを調査する。

要約

バクテリオファージ(ファージ)は、種レベルおよび株レベルの特異性を持つ細菌に感染するウイルスであり、既知のすべての生態系で最も豊富な生物学的実体です。腸内細菌叢に見られるような細菌群集内では、ファージは微生物叢の個体群動態を調節し、細菌の進化を促進することに関与しています。過去10年間でファージ研究への関心が再燃しており、その理由の一つは、溶解性ファージの宿主特異的な殺傷能力が、抗菌薬耐性菌の脅威の高まりに対抗するための有望なツールを提供していることです。さらに、ファージが腸粘液に付着することを示す最近の研究では、ファージが下にある上皮への細菌の侵入を防ぐ保護的な役割を担っている可能性があることが示唆されています。重要なことは、細菌のマイクロバイオームと同様に、ファジョームの破壊は炎症性腸疾患などの疾患の転帰の悪化と関連していることです。これまでの研究では、ファージが糞便濾液移植によって動物やヒトのマイクロバイオームを調節し、宿主の健康に利益をもたらすことが実証されています。この最近の研究の波により、腸内細菌叢の文脈でファージを研究するためのプロトコルを確立し、標準化する必要性が生じています。 このプロトコルはマウスの胃腸管において隔離されたT4バクテリオファージおよび細菌の宿主、 大腸菌を、調査する一組のプロシージャを提供する。ここで説明する方法は、ファージライセートから開始し、それをマウスに投与し、細菌の宿主とファージレベルへの影響を評価する方法を概説します。このプロトコルは他のバクテリオファージ細菌の組に修正され、加えることができ、生体内で宿主バクテリオファージの原動力を調査するための出発点を提供する 。

概要

バクテリオファージ(ファージ)は、細菌に感染して殺すウイルスで、種と菌株レベルの特^{異性があります}1。ファージは、腸内細菌叢などの複雑な細菌群集で重要な役割を果たしており、個体群動態の調節や細菌の適応度の向上に関与しています²。過去10年間、抗菌薬耐性病原体^の台頭3と、代替治療戦略としてのファージ療法の可能性により、ファージ研究への関心が再燃しています。近年、溶解性ファージカクテルは静脈内投与され、ヒトの重篤な抗生物質耐性細菌性敗血症感染症に一定の成功を収めています^3,4。経口ファージ療法は、腸の感染症や炎症を治療するための抗生物質の潜在的な代替手段としても提案されています。さらに、ファージは、早産ブタの再発性クロストリジオイデス・ディフィシル感染症(rCDI)^5,6、炎症性腸疾患(IBD)^7,8、壊死性腸炎の治療において、細菌を除去するためにろ過された糞便微生物叢製剤である糞便濾液移植(FFT)の成功に関与しています⁹

プロトコル

すべての実験は、UBC動物管理委員会およびバイオセーフティ委員会が承認したプロトコル(A23-0113、B19-0038)によって確立されたガイドラインに従って実施されました。マウスは、ブリティッシュコロンビア大学の疾病モデリングセンターの病原体のない条件下で飼育されました。C57BL/6マウスは、無菌マウスの餌、水、寝具、巣材を備えた無菌フレキシブルフィルムアイソレーターで施設内で飼育されました。マウスは12時間の昼/夜サイクルで維持された。実験用マウスは、雄と雌の両方で、各実験内で年齢を一致させ、生後6〜12週、体重15〜30gでした。

1. マウスへの経口強制経口投与用ファージおよびビヒクルライセートの調製

1. ファージの精製とストック生成
   注:この研究では、T4ファージを増殖させ、以下に説明する単一寒天層法を使用して細菌の芝生にメッキすることによって滴定します。二重寒天層法については、すでに説明したとおりである^25,27また、同様の効果で使用することもできます。このプロトコルでは、プラークの視認性が向上するため、寒天単層法が選択されました²⁸.
   1. 大 腸菌 を滅菌ポリスチレンまたはガラス....

ディスカッション

マイクロバイオームにおけるファージの研究は、細菌のファージと比較して大きな課題を提示します。具体的には、ファージは、原核生物と真核生物の種の配列決定と同定を容易にする16Sおよび18Sリボソームサブユニットに類似したすべてのファージに共通する保存された系統発生マーカーを含んでいない⁴²。しかし、リード長、スループットの増加、コストの削減など、?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100