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要約

この原稿では、初代水晶体上皮細胞(LEC)を培養するための詳細なビデオプロトコルの概要を説明し、白内障および後嚢混濁(PCO)の再現性を向上させ、研究を支援することを目的としています。レンズの解剖、LECの分離、バリデーションに関するステップバイステップの説明を提供し、特にこの分野の初心者にとって貴重なガイドとなります。

要約

水晶体上皮細胞(LEC)は、水晶体の恒常性と正常な機能を維持する上で複数の重要な役割を果たします。LECは、レンズの成長、発育、サイズ、透明度を決定します。逆に、機能不全のLECは、白内障の形成と後嚢混濁(PCO)につながる可能性があります。したがって、堅牢な一次LEC培養システムを確立することは、レンズ開発、生化学、白内障治療、PCO予防に従事する研究者にとって重要です。しかし、一次LECの培養は、入手可能性が限られていること、増殖速度が遅いこと、デリケートな性質のため、長い間課題となっていました。

この研究は、一次LEC培養の包括的なプロトコルを提示することにより、これらのハードルに対処します。このプロトコルには、最適化された培地の調合、水晶体カプセルの正確な単離、トリプシン処理技術、継代培養手順、収穫プロトコル、保管と出荷のガイドラインなどの重要なステップが含まれています。培養プロセス全体を通して、位相差顕微鏡を用いて細胞形態をモニターしました。

培養LECの真正性を確認するために、免疫蛍光アッセイを実施して、重要なレンズタンパク質、すなわちαAおよびγ-クリスタリンの存在と細胞内分布を検出しました。この詳細なプロトコールは、原発性LECの培養と特性評価のための貴重なリソースを研究者に提供し、水晶体生物学の理解の進歩と水晶体関連疾患の治療戦略の開発を可能にします。

概要

目の水晶体は、入射光を網膜に合わせることにより、視力において重要な役割を果たします。これは、特殊な細胞で構成される透明で無血管構造で構成されており、その中で水晶体上皮細胞(LEC)が重要な役割を担っています。LECは水晶体の前面に位置し、水晶体の透明性を維持し、水分バランスを調節し、水晶体の成長と発達に関与する役割を担っています1,2。LECは、水晶体の前部に位置するユニークなタイプの細胞であり、生涯を通じて水晶体線維を連続的に産生することにより、水晶体の透明度と機能を維持する上で重要な役割を果たします。

白内障は、水晶体の曇りが進行し、光の歪みや散乱を引き起こし、視力の低下につながります3,4。白内障形成の根底にある正確なメカニズムは複雑で多因子的であり、紫外線、酸化損傷、糖化などのさまざまな細胞および分子プロセスが関与しています5,6。LECは白内障の発症に大きく寄与することがわかっており、研究の重要な焦点となっています1,2,7,8,9。

さらに、今日の眼科における最も差し迫った問題の1つは、二次性白内障としても知られる後嚢混濁(PCO)の発生率が比較的高いことです。PCOは白内障手術後も最も一般的な合併症であり、手術後5年以内に成人患者の最大20〜40%、小児の100%が罹患します10。PCOは主に、白内障摘出後に莢膜バッグに残る残留LECによって引き起こされます。これらの細胞は、上皮から間葉への移行(EMT)だけでなく、LECから水晶体線維への分化を含む多面的な病態生理学的形質転換を受け、LEC、線維、筋線維芽細胞の混合物である細胞集団をもたらします11,12,13。形質転換された細胞は増殖し、後部水晶体嚢を横切って移動し、視力障害を引き起こします。培養モデルにおけるLECの挙動と制御メカニズムを理解することは、PCOの予防と管理に関する貴重な洞察を提供することができます。したがって、LECを培養するこのプロトコルは、この一般的な術後合併症を研究し、理解し、最終的に戦うことを目指す眼科研究者にとって重要なツールを提供します。

LEC生物学の複雑さと、白内障形成およびPCOにおけるLECの役割を解明するには、頑健で再現性の高い in vitro 初代細胞培養システムを確立することが不可欠です。初代LEC培養は、LECの機能、シグナル伝達、および分子特性を研究するための制御された環境を研究者に提供します。さらに、細胞プロセスやさまざまな実験条件の影響を調べることができ、水晶体の生理学や病理学に関する貴重な洞察を得ることができます。

以前の研究により、LEC培養技術の理解が深まりました14、15、16、17、18、19、20。これらの研究はさまざまな方法論を採用し、LECの行動と特性に関する重要な発見をもたらしましたが、LECを培養するための包括的でアクセス可能なビデオ録画プロトコルは現在の文献にはありません。この制限は、初心者の研究者が技術を正確に再現する能力を妨げ、実験結果の不整合やばらつきにつながる可能性があります。この研究論文は、ビデオ録画プロトコルを提供することにより、このギャップを埋め、LEC培養の分野で再現性を高め、知識の伝達を促進することができる標準化されたリソースを提供することを目的としています。

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プロトコル

すべての動物実験は、Association for Research in Vision and Ophthalmology(眼科および眼科研究における動物の使用に関するガイドライン)に従って実施されました。手続き上の承認は、ノーステキサス大学健康科学センターの動物ケアおよび使用委員会(プロトコル番号:IACUC-2022-0008)によって付与されました。これらの研究では、通常2週齢未満の若いC57BL/6Jマウスを使用しました。

1. 培地の調製と水晶体解剖

  1. 450 mLのDMEMに50 mLのウシ胎児血清(FBS)と0.1 mLの50 mg/mLゲンタマイシンを添加して培地を調製します。
  2. 生後2週間未満のC57BL/6Jマウスを人道的に安楽死させる。
    注:CO2吸入法を用いて安楽死させた。CO2安楽死システムの最適な流量は、チャンバーまたはケージの容積/分の30%から70%を変位させる必要があります。
  3. 手術用ハサミを使用してまぶたをそっと取り除き、眼窩の反対側に湾曲したピンセットで微妙な圧力をかけ、目を外側に突き出させます。白内障ナイフを使用して角膜を慎重に切開し、湾曲したピンセットを使用して水晶体を慎重に引き抜き、水晶体またはそのカプセルに損傷を与えないようにします。
    注意: レンズカプセルの完全性を維持するために、これらの手順を実行するときは注意してください。レンズはデリケートな性質を持っているため、レンズの損傷のリスクを最小限に抑えるために、先端が湾曲した鈍い解剖ツールを使用することが重要です。
  4. 先端が鈍い湾曲したピンセットを使用して、10 μg/mLのゲンタマイシンを含む5 mLの予熱滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)溶液で満たされた60 mmのプラスチック組織培養皿にレンズを移します。
  5. 10 μg/mLのゲンタマイシンを含むDPBS溶液でレンズを静かにすすぎ、潜在的な破片や汚染物質を取り除き、さらなる処理のためにレンズを準備し、無菌培養環境を維持します。
  6. 十分な数の LEC を得るには、24 ウェル培養プレートには 4 枚のレンズをプールし、6 ウェル培養プレートには 6 枚のレンズをプールします。

2. LECの分離

  1. すすぎプロセスが完了したら、レンズをろ紙の上に置き、乾かします。
  2. レンズが十分に乾いたら、レンズカプセルの取り外しの準備として、ペトリ皿のカバーに慎重に移します。
  3. レンズを上向きに回転させ、前眼部が上を向いていることを確認します。ピンセットを使用して前嚢を保持しながら、利き手の嚢嚢ヘキシス鉗子を使用して、嚢に小さな裂け目を作ります。2つのツールを反対方向にそっと引いてカプセルを取り出し、すべてのレンズの解剖が完了するまでDPBSに入れます。
    注:不一致を避けるために、研究者は各水晶体上皮カプセルを速やかに解剖し、DPBSに一時的に保存する必要があります。すべての解剖が完了した後にのみ、カプセルは37°Cに維持されたトリプシンにまとめて移され、同期された均一な曝露が保証されます。
  4. レンズカプセルを慎重に6ウェルプレートに移します。1 mLの0.05%トリプシン溶液を各ウェルに添加し、酵素消化プロセスを開始します。
  5. トリプシン溶液を静かに攪拌し、均一に浸透するようにします。プレートを細胞培養インキュベーターに入れ、カプセルを37°Cで8〜10分間消化します。
    注:このステップは、水晶体カプセル組織の破壊とその後の個々の上皮細胞の放出を容易にします。
  6. インキュベーション後、消化した水晶体カプセルを解剖ハサミを使用して慎重に細かく刻み、残っている組織塊を分解し、細胞分離を促進します。
    注:消化された水晶体カプセルからの効率的な細胞放出を確実にするために、組織ミンチの徹底性が強調されています。
  7. 10% FBSを含む培地0.5 mLを添加し、トリプシンをクエンチします。組織サンプルを遠心分離チューブに移し、1,000 × g で5分間遠心分離します。
  8. 細胞ペレットを乱すことなく、上清を慎重に除去します。1 mLの培地を使用して細胞を再懸濁し、細胞を24ウェルプレートに播種します。
  9. 培地は2〜3日ごとに交換してください。

3. LECのサブカルチャー

  1. 細胞が合流したら、培地を培養皿から取り出します。1 mLのDPBSで細胞を2回洗浄します。
  2. 200 μLのトリプシン-EDTA溶液を加え、細胞をインキュベーターに5分間入れます。
  3. インキュベーション後、細胞をインキュベーターから取り出し、顕微鏡で検査して、培養皿から分離して浮遊し始めたことを確認します。
  4. 1 mLの培地を加え、細胞を3〜5回静かにピペットで移し、すべての細胞を剥離します。
  5. 細胞を遠心チューブに移し、1,000 × g で5分間遠心分離します。
  6. 上清を慎重に除去し、細胞を完全な増殖培地に再懸濁します。
  7. 必要に応じて、血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。
  8. 細胞懸濁液を1:2または1:3の比率で細分化します。
  9. 培養が再び合流したら、前述の手順を繰り返します。
    注:LECは高密度培養条件で繁殖します。細胞を過度に希釈すると、細胞の成長を妨げる可能性があるため、避けてください。

4.保管と出荷

注: 保管に理想的なセル番号は ~1 × 106 です。

  1. 細胞を1 mLのDPBSで3回完全に洗浄します。洗浄後、1 mLのトリプシン-EDTA溶液を加え、細胞をインキュベーターに5分間入れます。
  2. 2 mLの完全培養培地を加え、細胞懸濁液を遠心チューブに移し、1,000 × g で5分間遠心分離します。
  3. 上清を捨て、細胞を90%FBSと10%DMSOからなる凍結培地に再懸濁し、×細胞密度が1〜106 細胞/mLになるようにします。細胞懸濁液をクライオバイアルに移します。
  4. 直ちに細胞を-20°Cの環境に1時間移動させ、続いて-80°Cで一晩泳がせてから、液体窒素中で永久保存します。
    注:液体窒素が利用できない場合は、-20°Cで最初の1時間後に-80°Cで保存できます。
  5. 輸送が必要な場合は、クライオバイアル内の細胞をドライアイス入りのパッケージに入れて翌日配送で輸送します。
  6. 細胞を受け取ったら、迅速に回収し、細胞を継代培養に入れます。即時培養が不可能な場合は、細胞を液体窒素に移して長期間保存してください。
    注:細胞を輸送する場合は、温度変動による損傷を防ぐために、サンプルがドライアイスに深く埋まっていることを確認してください。

5. LECのバリデーション

  1. LECをカバーガラスで35 mmの培養皿に播種し、約48時間培養します。
  2. 細胞をPBSで2回洗浄し、-20°Cで10分間、冷たいメタノールで細胞を固定します。
  3. 固定細胞をPBSで3 x 5分間洗浄し、固定細胞をブロッキングバッファーで室温で1時間インキュベートして、非特異的結合を防ぎます。
  4. ブロッキング後、希釈液バッファー中で1:50の比率で個別に希釈した一次抗体(αA-クリスタリン、γ-クリスタリン、およびPROX1抗体)とともに、細胞を4°Cで一晩インキュベートします。
  5. 細胞をPBSで3 x 5分間洗浄し、希釈液バッファー中で1:100に希釈した二次抗体で細胞を1時間インキュベートします。
  6. 細胞をPBSで3 x 5分間洗浄し、5 μg/mLのHoechst 33342 in PBSで室温で10分間細胞を染色して、核を可視化します。
  7. 細胞をPBSで2 x 5分間洗浄して余分な染色液を除去し、核にはDAPIチャネル、αA、γ-クリスタリン、およびPROX1にはFITCチャネルを使用して蛍光顕微鏡を使用して細胞の蛍光画像を撮影します。

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結果

図2に示すように、このプロトコールに従うことにより、C57BL/6Jマウスの初代LECは4時間以内にディッシュに接着しました。特に、後嚢の一部や水晶体線維細胞など、他の組織の目に見える残骸がありました。しかし、これらの意図しない元素は皿に付着しなかったため、培地を交換することで除去することができました。その後、3日目から5日目にかけて、LECは増殖段階?...

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ディスカッション

この論文で紹介するプロトコールは、一次LECの単離、培養、および継代培養を成功させるための包括的なステップバイステップガイドを提供し、付属のビデオドキュメントを完備しています。詳細なビジュアルガイドと書面による指示により、プロトコルの明確さとアクセス性が向上し、この分野の研究者の間での使用と再現性が促進されます。最終的な目的は、白内障形成とPCO、白内障手?...

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開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この作業は、NEI R21EY033941 (to Hongli Wu) の支援を受けました。国防総省W81XWH2010896(Hongli Wuへ);R15GM123463-02 (へ Kayla Green and Hongli Wu)

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher#25300054For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody Jackson ImmunoResearch#715-545-150For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003For cell validation
Antibody dilution bufferLicor#927-60001For cell validation
Beaver safety knifeBeaver-Visitec International#3782235For lens dissection
Blocking bufferLicor#927-60001For cell validation
Capsulorhexis forcepsTitan Medical InstrumentsTMF-124For lens capsule isolation
DMEMSigma AldrichD6429For LECs culture medium
DMSOSigma Aldrich#D2650For making freezing medium 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher#J67802For lens dissection
Dumont tweezersRoboz Surgical InstrumentRS-4976For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)ScienCell4182For LECs culture medium
FBSSigma AldrichF2442For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)Sigma-AldrichG1397For LECs culture medium
Hoechst 33342 solutionThermo Fisher#62249For cell validation
Micro-dissecting scissorsRoboz Surgical Instrument RS-5983For lens dissection
Micro-dissecting tweezersRoboz Surgical Instrument RS5137 For lens dissection
PROX1 antibodyThermo Fisher11067-2-APFor cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissorsRoboz Surgical InstrumentRS-5608For lens capsule isolation
αA-crystallin antibodySanta Cruzsc-28306For cell validation 
γ-crystallin antibodySanta Cruzsc-365256For cell validation

参考文献

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