Ex Vivo(エクス・ビボ)胎盤外植体フロー培養 - 子宮内の動的条件の模倣

要約

これは、一定のフロー条件下で胎盤外植片を培養するためのプロトコルです。このアプローチは、動的な生理学的環境の複製を可能にすることで、従来の静的な絨毛培養システムを強化します。

要約

既存の ex vivo 胎盤外植片培養モデルは、主にウェルプレートを用いた静的培養システムに基づいています。しかし、これらのモデルは、胎盤が血漿や血流によって一定のわずかなせん断応力を受ける子宮 内 環境の動態を十分に反映していない。この制限に対処するために、 ex vivo 胎盤外植片培養を母体内で経験する 子宮内 フロー条件に近づけるフロー培養システムが考案されました。このアプローチでは、胎盤外植片は、相互接続された5つのフローチャンバーのシーケンスで培養されます。この設定により、生理的な酸素濃度と一定の流量が維持されます。収集されたデータは、流動条件下で、組織形態の保存が従来の静的方法と比較して顕著な向上を示すことを明らかにしています。この革新的な技術は、 ex vivo胎盤外植片培養の簡単な方法を導入し、 in vivo 環境のダイナミックさをより忠実に表現します。さらに、本研究は、胎児と母体の界面の機能動態を研究するための新たな可能性をもたらす。実行可能な動的方法論を採用することにより、胎盤生物学のより深い理解が促進され、母体と胎児の健康との関連性が強調されます。

概要

1960年代以降、ウェルプレートの底部での胎盤外植片培養は、胎児と母体の界面の研究に利用されてきました^1,2,3。この方法は確立されており、簡単で、単一細胞の培養に加えて、さまざまな研究にヒト組織を利用することができます^2,3。時が経つにつれて、胎盤外植片培養の実験デザインは、酸素濃度⁴に関して、および組織がウェルプレート^の底部に沈降するのを防ぐために変更されてきました^2,5,6。しかしながら、この方法は、子宮内の生体内条件、特に^{一定の流量の存在}には適合していない3。

妊娠の成功は、絨毛間腔に母体の血液を適切かつ一貫して灌流し、血液と血液媒介物質の継続的な流入と流出を伴う動的回路を確立することにかかっています7,8,9,10,11,12。胎盤は、母体と胎児の血液の2つの異なる血液供給システムを特徴としており、その結果、胎児系と母体システムの両方による二重灌流が行われます¹³。母体の血液は、妊娠初期の終わりに胎盤の絨毛間腔を灌流し始め、広がった子宮のらせん動脈をゆっくりと流れます10,11,14。その結果、胎盤絨毛樹は母体の血液を浴び、胎児に栄養と酸素を届けます。この母体の血液は、子宮胎盤静脈を介して母体の循環に戻る前に、絨毛間腔を流れます。絨毛間腔を通過する間、胎児の血液への酸素と栄養素の拡散と活発な取り込みにより、母体の血液中の酸素と栄養素のレベルが低下します^12,15。しかし、絨毛空間の血液は、毎分約2〜3回、新鮮で酸素が豊富な血液に完全に置き換えられ、栄養素とガスの継続的な供給を保証します¹³。特に、胎盤関門の最も外側の部分である合胞体栄養膜は、母体の血液に直接さらされる胎盤絨毛樹の唯一の構成要素です15,16,17。その結果、合胞体栄養膜は、流れる母^{体の血液から}一定の軽度のせん断応力を受ける^3,14。

胎盤流動環境に関する現在の科学的知識と現代の技術的進歩により、流動条件下での胎盤外植片の培養が適応し、生理学的に近似できるようになりました。さらに、せん断力が合胞体栄養膜の生物学的機能に影響を与えることを示唆する証拠があります18,19,20,21。血流を説明する周知のアプローチは、胎盤二重葉灌流システム²²である。しかし、これらの実験には相当な専門知識が必要であり、時間制限があり(数時間しか実施できない)、妊娠後期の胎^{盤サンプルで}しか実行できない^3,23。これに対し、妊娠初期と妊娠後期の両方の胎盤組織を収容し、一定の流量設定下でのex vivo胎盤絨毛外植片培養のための簡単で非侵襲的な技術^{を開発しました3。}このセットアップでは、胎盤外植片は直列接続された5つのフローチャンバーで培養されます。絨毛の外植片は、薄い金属板の針状の隆起を使用してチャンバーの底部に固定されています。構築された流動回路は、その後、酸素濃度と流量の両方が調節されるバイオリアクターに移されます³。フロー培養の結果は、通常使用される静的な方法³と比較して、組織の完全性がよりよく保たれることを実証しています。さらに、このダイナミックなアプローチにより、組織外植片培養の新規かつ適応された実験デザインが可能になり、自然環境をより忠実に模倣したin vitro実験が可能になります³。

プロトコル

グラーツ医科大学の倫理委員会は、この研究を承認しました (31-019 ex 18/19 バージョン 1.2 および 29-319 ex 16/17)。インフォームドコンセントは、研究に関与したすべての被験者から得られました。

1. フロー実験の準備

注:実験は、蠕動ポンプを内蔵したバイオリアクターで行われます( 材料表を参照)。バイオリアクター内の湿度、温度、ガスレベルを調整できます。

1. バイオリアクターの電源を入れ、バイオリアクターのマニュアルに従って、実験のすべての事前準備(ポンプの校正、事前加温、ガス条件、湿度など)を行います。実験を開始する前に、必要な設定(温度、ガス含有量、湿度)を数時間または一晩安定させる必要があります。これを行うには、バイオリアクターとソフトウェアを起動し、メニュー項目「インキュベーター」の下の「 セットポイントの変更 」をクリックします。
2. PBSと必要な培地(付属のサプリメントhEGF-5、HC-500、および5%エキソソーム枯渇ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した内皮細胞増殖培地)( 材料表を参照)を37°Cに予熱します。
   ​

2.胎盤サンプルの解剖

1. 分娩後すぐに、胎盤中央部から^2cm3の胎盤サンプルを3回切断し、Kupperら3に記述されているように、簡単に、サンプルをPBSに保管する。絨毛膜板、母体の脱落膜、および目に見える梗塞の領域を標本から廃棄します。
2. 残りの組織標本を、断面直径約0.5cm(湿重量約7.5mg)の絨毛外植片に解剖する。それらを新鮮なPBSでペトリ皿に移します。
3. PBSで外植片をピンセットで液体中で静かに振って洗浄し、血液残留物を取り除きます。
   注:PBSを使用してペトリ皿でサンプルを解剖して、事前に洗浄して乾燥を防ぎ、滅菌/オートクレーブ滅菌したツールを使用して組織を処理します。

3. 流動実験

1. 滅菌フードの下で、フローチャンバーのユーザーマニュアルに従って、ルアーロックを使用して5つのチャンバーをリザーバーボトルに直列に接続します( 材料表を参照)。
   注意: それぞれのマニュアルに従って、使用前にすべての材料を滅菌および/またはオートクレーブしてください。リザーバーボトルにエアフィルターを使用して、滅菌ガス交換を行います。チャンバーを開閉するには、チャンバーのラグをそっと押し込みます。ステップ 3.1.また、早めに準備することもできます。
2. チャンバーを逆さまにし、底を取り外して開きます。鉗子を使用して、ピンが上を向くように、チャンバーの上部の中央に金属板を移します。
3. チャンバーに予熱した培地(37°C)1 mLを充填します。次に、リザーバーにさらに20 mLを入れます。この回路には、各フローチャンバー、チューブ、リザーバーボトルの容量を含めて合計25 mLが必要です。この流れでは、充填チャンバー内の培地の最終容量は2 mLです。
4. 鉗子を使用して、チャンバー内の金属板の針の間に絨毛外植片を次々と移します。組織の穿刺を避けるために、針を胎盤絨毛の間をスライドさせます。4つの外植片を1つのチャンバーに移します。底部を慎重に取り付け直してチャンバーを閉じます。完全な回路には、合計20個の外植片が含まれています。チャンバーは逆さまの位置にとどまる必要があります。
   注意: 鉗子で外植片をそっとつかみます。それらを絞らないようにしてください。漏れを防ぐために、チャンバーと回路が完全に密閉されていることを確認してください。チャンバーは常に逆さまに使用します。チャンバーあたりの外植片の数とチャンバー自体の数は可変です。妊娠初期組織の手順は、妊娠後期の組織の場合と似ていますが、少し追加されています:絨毛を固定するには、組織が金属プレートに移された後、外植片の上で針をわずかに曲げます(私信Bruggerら)。これにより、壊れやすい組織が金属板に固定され、サンプルが滑り落ちるのを防ぎます。
5. フローアセンブリーをバイオリアクターに移します。
6. ポンプチューブをポンプに接続して、バイオリアクター内の蠕動ポンプに流量回路を接続します。第^{4段階で修正} します(4回カチッという音が聞こえます)。
7. 静電気制御が必要な場合は、ウェルプレートもバイオリアクターに入れます。
   注:静的培養では、6ウェルプレートの5ウェルに、ウェルあたり4 mLの培地と、ウェルあたり4つの絨毛外植片を充填します。充填されたウェルプレートもバイオリアクターに入れられ、フロー培養外植片と同じ雰囲気で培養されます。詳細については、Kupper et ^al.3 を参照してください。
8. メニュー項目「ポンプ」でポンプモードを 手動 に設定します。次に、ポンプ速度を 1 mL/分に設定し、[ 分析]をクリックしてチューブへの培地のポンプ送りを開始します。回路が培地で満たされている間は、チャンバーが完全に培地で満たされるように、チャンバーを斜めに保持します。
   注:胎盤絨毛流動および静的培養の実験設定については、 補足表1 を参照してください。フローおよび静的システムの仕様は、 補足表2に記載されています。
   注意:充填中は、試験片がニードルから滑り落ちないようにチャンバーを慎重に傾けてください。
9. 充填が完了した後、チャンバーは逆さまの位置に留まります。チャンバーがしっかりと直立していることを確認し、バイオリアクターの両方の蓋を閉じます。
   注:充填されたフローチャンバー内の培地の最終容量は 2 mL です。実験で使用したフローチャンバーとウェルプレートの実験設定と仕様は、Kupper et ^al.3 に記載されています。
10. 組織を所望の時間インキュベートします。
    注:温度、ガスレベル、流量は、バイオリアクターの蓋を再度開けることなく、コンピューター上で監視できます。
11. 組織を所望の時間インキュベートした後、メニュー項目「ポンプ」の下の 「中止 」をクリックしてポンプを停止します。バイオリアクターの 2 つの蓋を開けてから、一度に 1 つのフローチャンバーを開きます。鉗子を使用して金属板から外植片を慎重に取り除きます。
12. 選択したダウンストリーム分析に従って組織と上清を処理します。この場合、免疫組織化学的染色と電子顕微鏡^{検査が行われました}3。免疫組織化学および免疫蛍光法に用いる抗体の詳細については、 付表3 を参照のこと。
    注意: ティッシュを取り除いた後、ポンプを反時計回りに回転させて回路から培地を排出します。
13. フローチャンバーとチューブの製造元の指示に従って、フロー回路を分解して清掃します。

ディスカッション

この研究は、胎盤外植片の流動培養技術に関するユニークな視点を導入し、子宮内^環境の動態を再現する^3,23。この知見は、流動条件下で培養された組織の形態が、従来の静的培養法と比較してよりよく保存されることを明らかにし^ている3。特に、静的培養条件もフロー培養条件も胎盤血管の灌流を促進しないにもかかわらず、絨毛間質内の胎児胎盤血管の破壊は静的培養で主に観察されたのに対し、^{フロー培養では}血管の完全性が長期間にわたってよりよく維持されるようでした3。

この観察の1つの可能な説明は、合胞体栄養膜の重要な保護および内分泌の役割に関連している可能性があり、その機能は文献12,24,25,26で十分に文書化されています。これを考えると、絨毛の外層の全体的な完全性は、血管を含む下層間質の維持に大きく寄与すると考えられる。その結果、流動条件下での血管の持続的な細胞完全性は、培地の連続的な流れに起因する可能性があります。この動きは、外植片の受動的な動きを助け、胎盤関門を越えたガス、栄養素、ナノ粒子(細胞外小胞など)の交換を促進します。これは、ひいては血管形態の保存にプラスの影響を与える可能性があります。さらに、機械感覚の現象は、さまざまな組織にわたる組織の形態形成に関与しています^27,28。研究によると、機械感受性は複数のレベルで細胞プロセスに影響を与え、最終的に組織や臓器の機能に影響を与えるさまざまな生化学的応答を引き起こします²⁹。特に、機械感受性タンパク質は、妊娠中ずっと合胞体栄養芽細胞によって発現されます²⁸。さらに、この研究は、組織表面の微絨毛がこの文脈に関与している可能性があることを示唆しています²⁸。

検討に値する追加の視点は、フローに対する細胞応答におけるミトコンドリアの潜在的な役割です。例えば、内皮細胞では、ミトコンドリアは環境刺激に対する細胞応答のシグナル伝達因子として機能する³⁰。^TEM3を介して静的培養組織に観察された脂質滴の蓄積の増加は、ミトコンドリア機能障害によるアポトーシス誘導と関連している³¹。根本的なメカニズムと重要な要因を明らかにし、それらを下流のシグナル伝達経路に結び付けるには、さらなる調査が必要です。この調査は、組織がせん断応力をどのように認識し、反応するかについての理解を深め、培養中の絨毛外植片の生存率と完全性の向上につながる可能性があります²³。

いくつかの重要なプロトコルステップを繰り返し、慎重に実行する必要があります。胎盤分娩後、組織はできるだけ早く培養する必要があります。外植片の準備中は、目に見える梗塞のある領域を避けることが重要です。圧迫を防ぐために、鉗子で外植片を優しく扱うことが重要です。施術中は組織を液体で覆い、迅速に行うことをお勧めします。

この研究は、提示された流れシステム内の正確なせん断応力を特定することができないことを認識することが重要であり、これは将来の調査の限界として考慮されるべきである^3,23。それにもかかわらず、特定の胎盤絨毛の正確な流速とせん断応力は、絨毛間空間の幾何学的特性、この空間内の絨毛の位置、母体の螺旋動脈と子宮静脈への近接性と角度など、多くのパラメータの影響を受けることを認識することが重要です3,19,23,32 .胎盤の幾何学的構造の複雑さは個人によって異なるため、同様に考慮に入れる必要があります^23,32。絨毛間腔³²内の血流を推定する数理モデルと、合胞体栄養膜^19,28に対する壁せん断応力の計算は、すでに存在する。興味深いことに、ある研究では、合胞体栄養芽細胞のせん断応力は妊娠初期と比較して妊娠第3期の方が低いと予測され²⁸、別の研究では合胞体栄養膜に対する空間的に不均一な壁せん断応力が実証されました¹⁹。特定の胎盤絨毛の正確な流速とせん断応力を決定することは、依然として課題です3,19,23,32。このような計算は、将来の調査のためにせん断応力範囲の近似値を提供しますが、継続的な解剖学的調整と最適化が必要になる場合があります²³。さらに、今後の研究では、絨毛間空間の複雑な形状を説明する新しい洗練されたフロースルー培養技術と^{、実験あたり}の検体数を増やすための戦略が開発される可能性があります3。フローシステムの継続的な進歩と開発が予想され、代替フローチャンバーを採用する可能性があります(Brugger et al.、未発表データ、2023年)。

結論として、この研究は、培養された絨毛外植片の構造的完全性を維持する、簡単に実装可能なex vivoフロー培養技術を実証することにより、堅牢な基盤を築きます。これは、胎盤機能生物学研究における動的手法の重要性を強調し、フロー培養システムのさらなる進歩と新しいアイデアや仮説の生成への道を開きます^3,23。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plates	NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	140675
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	A21422	Diluted in PBS, 1:200
antibody diluent	Dako, Santa Clara, CA, USA	S3022
anti-β-actin (AC-15)	Abcam, Cambridge, UK	ab6276	Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000
Bioreactor TEB500	TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain		Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117
CD34 Class II (QBEnd-10)	Dako, Santa Clara, CA, USA	M7165	Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500
CPD 030 critically point dryer	Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein)		Critically point dryer
DAPI	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	D21490	Diluted in PBS, 1:1000
Ebers TEB505 Series Software	TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain		Series Software 1.4
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;	C-22120	Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used
Excelsior AS Tissue Processor	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Exosome-depleted fetal bovine serum	Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	A2720803
Histolab Clear	Histolab, Askim, Sweden	14250-TY
Hydrogen Peroxide Block	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TA125H202Q
Kaiser’s Glycerin Gelatine	Merck, Darmstadt, Germany	1092420100
Leica DM 6000 B microscope	Leica, Wetzlar, Germany		Equipped with an Olympus DP 72 Camera
Leica UC7 ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna, Austria)
Metal plate with needles	In-house construction
Microtome	Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA
Microwave oven	Miele, Guetersloh, Germany
Olympus microscope  (BX63)	Olympus, Hamburg, Germany		Serial Number: 1A52421
PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	10010015
Penicillin/Streptomycin	Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	2585627
Primary antibody enhancer	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TL-125-PB
ProLong Gold Antifade Reagent	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	P36934
Pumping tube	Tygon, Bartelt, Graz, Austria	6.078 175	1.02 mm diameter
QV500 Flow chambers	Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK	QV500	Other chambers would work as well
SCD 500, sputter coater	Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein		Sputter coater
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit	Abcam, Cambridge, UK	ab64252
Superfrost Plus slides	Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany	J1800AMNZ
Syringe Filter	Corning Incorporated, NY, USA	431219	0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle
TAAB epoxy resin	Agar Scientific, Stansted, Essex, UK	T001
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TL-125-HL
UltraVision Protein Block	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	TA125BPQ
Zeiss EM 900 transmission electron microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope	Zeiss, Cambridge, UK		Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage