神経疾患のモデル化と治療標的化のための血液脳関門の in vitro 再構築

要約

血液脳関門(BBB)は、安定した健康な脳環境を維持する上で重要な役割を果たしています。BBB機能障害は、多くの神経疾患と関連しています。私たちは、脳血管の病理学、BBBの完全性、およびBBBが遺伝学や疾患によってどのように変化するかを調べるために、BBBの3D幹細胞由来モデルを開発しました。

要約

血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)の重要な生理学的構成要素であり、栄養素を維持し、老廃物を取り除き、病原体から脳を保護します。BBBの固有のバリア特性は、神経疾患を治療するための中枢神経系への治療薬送達に課題を提起します。BBB機能障害は神経疾患に関連しています。脳血管系にアミロイドが沈着してBBBが損なわれる脳アミロイド血管症(CAA)は、アルツハイマー病(AD)のほとんどの症例で併存疾患であり、BBBの機能不全または破壊が神経変性に関与している可能性があることを示唆しています。ヒトBBB組織へのアクセスが限られているため、適切なBBB機能とBBB変性に寄与するメカニズムは不明のままです。これらの限界に対処するために、私たちは、内皮細胞、周皮細胞、およびアストロサイトを3Dマトリックスに組み込むことにより、ヒト多能性幹細胞由来BBB(iBBB)を開発しました。iBBBは自己組織化して、BBBに存在する解剖学的構造と細胞相互作用を再現します。iBBBにアミロイドを播種することで、CAAの重要な側面を捉えることができます。さらに、iBBBは、脳血管疾患や神経変性に関与する遺伝的要因や環境要因を調節し、遺伝学や生活習慣が疾患リスクにどのように影響するかを調査するための柔軟なプラットフォームを提供します。最後に、iBBBは、中枢神経系への治療送達を最適化するための薬物スクリーニングおよび創薬化学研究に使用できます。このプロトコルでは、ヒト多能性幹細胞から生じる3種類の細胞(内皮細胞、周皮細胞、アストロサイト)の微分、iBBBに分化した細胞を組み立てる方法、および外因性アミロイドを使用して生体 外で CAAをモデル化する方法について説明します。このモデルは、生物学的忠実度と実験の柔軟性の両方を備えたシステムを使用して、生きたヒト脳組織を研究するという課題を克服し、ヒトBBBと神経変性におけるその役割の調査を可能にします。

概要

血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)を末梢から分離し、適切な神経機能に理想的な環境を維持する重要な微小血管ネットワークです。代謝ホメオスタシス^を維持し1,2,3,4、老廃物^4,5,6を除去し、病原体や^毒素から脳を保護することにより、中枢神経系への物質の流入と流出を調節する上で重要な役割を果たします^7,8。

BBBの一次細胞型は内皮細胞(EC)です。中胚葉系統に由来する内皮細胞は、血管系の壁を形成します^1,9。微小血管ECは互いにタイトジャンクションを形成して膜の透過性を大幅に低下させる一方で、トランスポーターを発現して中枢神経系への栄養素の出入りを促進する

プロトコル

1. iPS細胞からiBBB細胞への分化

注:これらの分化プロトコルは、Mesentier-Louro et ^al.34で以前に説明されています。

1. 細胞培養プレートのコーティング
   1. 還元成長因子(GF)メンブレンマトリックスを4°Cで一晩融解します。 500 μL の基底膜マトリックスを 49.5 mL の DMEM で希釈します。コーティング液の早期重合を防ぐために、この溶液を冷たく保ちます。
   2. 6ウェル組織培養処理プレートのウェルあたり1〜2 mLを添加します。コーティング液を37°Cで20分以上放置してから、適切な加温培地と交換してください。
2. ヒトiPS細胞のETV2誘導性内皮細胞への分化
   タイミング:8日間
   注:このプロトコルは、Blanchardら²⁴ およびQianら³⁵から採用されています。我々は、Wang et ^al.36 によって記述されているように、転写因子ETV2のドキシサイクリン誘導性発現を使用して収量を改善します。ETV2をPiggyBacプラスミドを介して導入し、細胞をトランスフェクションしました。
   1. iPS....

ディスカッション

BBB機能障害は併存疾患であり、多くの神経疾患の原因または悪化因子である可能性があります^7,40,41。しかし、神経血管疾患のヒトにおけるBBBの機能不全と破壊の根底にある分子生物学および細胞生物学を研究することはほぼ不可能です。このプロトコルで示される誘導性BBB (iBBB)は管管の形成および血管系のastrocyte端フィ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6e10 amyloid-β antibody	Biolegend	SIG-39320	Used at 1:1000
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Activin A	Peprotech	20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies	Invitrogen	Various	Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril	AnaSpec	AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril	AnaSpec	AS-20276
Aquaporin-4 antibody	Invitrogen	PA5-53234	Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements	ScienCell	1801
B-27 serum-free supplement	Gibco	17504044
BMP4	Peprotech	120-05ET
CHIR99021	Cyamn Chemical	13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium	Gibco	10565018
Doxycycline	Millipore-Sigma	D3072-1ML
FGF-basic	Peprotech	100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium	VWR	100502-406
Forskolin	R&D Systems	1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement	Gibco	A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes	Mattek Corporation	P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement	Gibco	35050061
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Human Endothelial Serum-free medium	Gibco	11111044
LDN193189	Tocris	6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)	Gibco	11140050
N-2 supplement	Gibco	17502048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Millipore-Sigma	S30-100mL	Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher	28908
PDGF-BB	Peprotech	100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody	R&D Systems	AF385	Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Gibco	10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody	R&D Systems	AF806	Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)	AddGene	Catalog #168805
S100B antibody	Sigma-Aldrich	S2532-100uL	Used at 1:500
SB43152	Reprocell	04-0010
Thioflavin T	Chem Impex	22870	Used at 25uM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody	R&D systems	AF938	Used at 1:500
VEGF-A	Peprotech	100-20
Y27632	R&D Systems	1254/10
ZO-1	Invitrogen	MA3-39100-A488	Dilution = 1:500