Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査

要約

Ex vivo ライブイメージングは、生体組織における細胞の動きや相互作用のダイナミックなプロセスを研究するための強力な技術です。ここでは、培養された成体マウス切歯全体の歯上皮細胞をライブトラッキングするために2光子顕微鏡法を実装するプロトコルを紹介します。

要約

成長を続けるマウス切歯は、成体上皮幹細胞や間葉系幹細胞の調節や歯の再生を研究するための扱いやすいモデル系として注目されています。これらの前駆細胞集団は、組織の恒常性を維持し、失われた細胞を応答的に再生するために、活発に分裂、移動、分化します。しかし、固定された組織切片を用いた従来の解析では、細胞の動きや相互作用のダイナミックなプロセスを捉えることができず、その制御を研究する能力が制限されていました。この論文では、外植片培養システムでマウス切歯全体を維持し、多光子タイムラプス顕微鏡を使用して歯上皮細胞をライブトラックするプロトコルについて説明します。この技術は、歯科研究のための既存のツールボックスに追加され、研究者が生体組織内の細胞の挙動と組織に関する時空間情報を取得することを可能にします。この方法論は、研究者が歯の再生と再生の両方で起こる動的な細胞プロセスを制御するメカニズムをさらに探求するのに役立つと期待しています。

概要

過去20年間で、マウス切歯は成体幹細胞の調節と歯の再生の原理を研究するための非常に貴重なプラットフォームとして浮上してきました^1,2。マウス切歯は継続的に成長し、動物の生涯を通じて再生します。これは、上皮幹細胞と間葉系幹細胞の両方を維持することによって行われ、自己複製して歯のさまざまな細胞型に分化することができます^1,2。歯の上皮幹細胞はエナメル質マトリックスを分泌する髄芽細胞を生じさせるのに対し、歯の間葉系幹細胞は歯芽細胞、セメント芽細胞、線維芽細胞を生じさせ、それぞれ象牙質、セメント質、歯根膜を形成します3,4,5,6。この新しい細胞の絶え間ない供給は、組織の恒常性を維持し、咀嚼の摩耗や損傷のために失われた古い細胞の交換を可能にします^7,8。したがって、歯科幹細胞の維持と分化を調節する細胞および分子メカニズムの解明は、関心が高....

プロトコル

すべてのマウスは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)またはエルサレムヘブライ大学(HUJI)の病原体のない動物施設で飼育されました。マウスを用いたすべての実験は、それぞれの動物管理委員会(IACUC)によって承認された規制およびプロトコルに従って実施されました(ARC-2019-013;UCLA)または(MD-23-17184-3;HUJI)です。実験ステップの一般的なワークフローを 図2Aに示します。このプロトコルで使用されるすべての機器、試薬、および材料に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 溶液およびゲルの調製

1. 解剖培地:0.5%グルコースで新鮮なDMEM/F12を調製し、ステップ2.4で必要になるまで37°Cで保温します。
   注:フェノールレッドを含まないDMEM/F12を使用して、ライブイメージング中の自家蛍光を低減します。
2. 培地 1x:50% DMEM/F12、ラット血清 50%、グルタミン代替物 1x 、MEM 非必須アミノ酸 1x MEM、グルコース 1%、L-アスコルビン酸 0.1 mg/mL L-アスコルビン酸、ペニシリン-ストレプトマイシン 0.5% を使用して、新鮮な培地を調製します。ステップ5.5で必要になるまで、37°Cで保温します。この培地は、....

ディスカッション

生組織イメージングは、細胞がニッチな環境で維持されるときの細胞の動的なプロセスと挙動を研究することを可能にする重要な技術です⁴¹。理想的には、ライブイメージングは、高い時空間分解能で in vivo で行われます。しかし、哺乳類器官の in vivo イメージングは、組織へのアクセス不能、光学的不透明性、および動物または器官を長期間固定することの?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09