単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用

要約

極低温電子顕微鏡(クライオEM)グリッドに支持層を適用することで、粒子密度を高め、空気と水の界面との相互作用を制限し、ビーム誘起運動を低減し、粒子配向の分布を改善することができます。この論文では、クライオサンプル調製を改善するために、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェンの単層でコーティングするための堅牢なプロトコルについて説明します。

要約

極低温電子顕微鏡(クライオEM)では、精製された高分子を穴あき炭素箔を含有するグリッドに塗布します。次に、分子を吸い取って余分な液体を除去し、約20〜100 nmの厚さのガラス質氷の層で急速に凍結し、幅約1 μmの箔穴に懸濁させます。得られた試料は、極低温透過型電子顕微鏡を用いて画像化され、適切なソフトウェアを用いて画像処理を行った後、原子分解能に近い構造を決定することができる。クライオ電子顕微鏡は広く採用されていますが、サンプル調製は依然としてクライオ電子顕微鏡ワークフローにおける深刻なボトルネックであり、ユーザーは懸濁したガラス質の氷の中でサンプルの挙動が悪いという課題に遭遇することがよくあります。最近では、グラフェンの単一の連続した層でクライオ電子顕微鏡グリッドを修飾する方法が開発されており、グラフェンは支持面として機能し、多くの場合、画像領域内の粒子密度を高め、粒子と空気-水界面の間の相互作用を減らすことができます。ここでは、グラフェンをクライオ電子顕微鏡グリッドに適用し、得られたグリッドの相対的な親水性を迅速に評価するための詳細なプロトコルを提供します。さらに、グラフェンの特徴的な回折パターンを可視化することでグラフェンの存在を確認するEM法についても述べる。最後に、比較的低濃度の純粋なサンプルを用いて、Cas9複合体の2.7 Åの分解能密度マップを迅速に再構築することにより、これらのグラフェン担体の有用性を実証します。

概要

単粒子極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、生体高分子を可視化するために広く使用されている方法に進化しました¹。直接電子検出 ^2,3,4、データ取得⁵、画像処理アルゴリズム ^6,7,8,9,10 の進歩により、クライオ電子顕微鏡は、急速に増加する高分子の原子分解能に近い分解能の 3D 構造を生成できるようになりました ¹¹.さらに、このアプローチの単一分子の性質を活用することにより、ユーザーは単一のサンプルから複数の構造を決定することができ^{12、13、14、}

プロトコル

1. CVDグラフェンの作製

1. グラフェンエッチング液を以下のように調製する。
   1. 4.6 gの過硫酸アンモニウム(APS)を20 mLの分子グレードの水に50 mLのビーカーに溶解して1 Mの溶液にし、アルミホイルで覆います。APSを完全に溶解させながら、手順1.2に進みます。
2. メタクリル酸メチル(MMA)コーティング用のCVDグラフェンの切片を調製します。CVDグラフェンの正方形の断面を慎重に切断します。正方形を清潔なペトリ皿内のカバーガラス(50 mm x 24 mm)に移し、スピンコーターへの輸送中にカバーします。
   注:18 mm x 18 mmの正方形は、25〜36個のグラフェンコーティングされたグリッドを生成する必要があります。

2. CVDグラフェンをMMAでコーティング

1. スピンコーターの設定を、2,500rpmで60秒の高速スピンに設定します。CVDグラフェンを適切なサイズのチャックに慎重に配置します。
   注:理想的には、CVDグラフェンは、MMAが真空システムに入るのを防ぐために、選択したチャックの端に1〜2mm伸びます。
2. Take/Absorbボタンを押して真空ポンプを作動させ、CVDグラフェンをチャックに固定します。CVD....

ディスカッション

クライオ電子顕微鏡によるサンプル調製には多くの技術的課題が伴い、ほとんどのワークフローでは、脆弱なグリッドを損傷しないように細心の注意を払って手動で操作する必要があります。さらに、ガラス化に対するサンプルの適応性は予測不可能です。粒子は、空気と水の界面やグリッドを覆う固体支持箔と相互作用することが多く、非常に高いタンパク質濃度を適用しない限り、粒子?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL beaker (3x)	Fisher	02-555-25B
50 mL beaker (2x)	Corning	1000-50
Acetone	Fisher	A949-4
Aluminum foil	Fisher	15-078-292
Ammonium persulfate	Fisher	(I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm	Mattek	PCS-1.5-5024
CVD graphene	Graphene Supermarket	CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger	Ted-Pella	91000S
Ethanol	Millipore-Sigma	1.11727
Flat-tip tweezers	Fisher	50-239-60
Glass cutter	Grainger	21UE26
Glass petri plate and cover	VWR	75845-544
Glass serological pipette	Fisher	13-676-34D
Grid Storage Case	EMS	71146-02
Hot plate	Fisher	07-770-108
Isopropanol	Sigma	W292907
Kimwipe	Fisher	06-666
Lab scissors	Fisher	13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6	Kayaku	MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water	Corning	46-000-CM
Negative action tweezers (2x)	Fisher	50-242-78
P20 pipette	Rainin	17014392
P200 pipette	Rainin	17008652
Parafilm	Fisher	13-374-12
Pipette tips	Rainin	30389291
Quantifoil grids with holey carbon	EMS	Q2100CR1
Spin coater	SetCas	KW-4A	with chuck SCA-19-23
Straightedge	ULINE	H-6560
Thermometer	Grainger	3LRD1
UV/Ozone cleaner	BioForce	SKU: PC440
Vacuum desiccator	Thomas Scientific	1159X11
Whatman paper	VWR	28297-216