タンパク質間相互作用を研究するための抗エピトープタグアフィニティーゲルによる免疫沈降(英語)

要約

タンパク質間相互作用は、標的タンパク質の機能解明に重要であり、共免疫沈降(co-IP)によりPPIを容易に確認することができます。エピトープタグ付きタンパク質をコードするプラスミドをHEK-293細胞に一過性にトランスフェクションし、2つの標的タンパク質の結合を簡便に確認できる免疫沈降法を開発しました。

要約

タンパク質間相互作用(PPI)は、細胞組織化、細胞内シグナル伝達、転写調節などの生物学的現象において極めて重要な役割を果たします。したがって、PPIを理解することは、標的タンパク質の機能をさらに調査するための重要な出発点です。本研究では、ポリエチレンイミン法を用いて哺乳類の発現ベクターをHEK-293細胞に導入し、自家製タンパク質溶解バッファー中で細胞を溶解し、エピトープタグアフィニティーゲル上で標的タンパク質を引き下げることにより、2つの標的タンパク質の結合を決定する簡単な方法を提案します。また、種々のエピトープタグ融合タンパク質間のPPIは、エピトープタグアフィニティーゲルの代わりに各タグに対するアフィニティー抗体を用いることで確認することができます。このプロトコルは、他の細胞株からの核抽出物を含むさまざまなPPIの検証にも使用できます。そのため、様々なPPI実験の基本的な手法として活用できます。タンパク質は、長時間の経過と凍結融解の繰り返しによって分解されます。したがって、細胞溶解、免疫沈降、および免疫ブロッティングは、可能な限りシームレスに実行する必要があります。

概要

タンパク質は、情報処理、代謝、輸送、意思決定、構造構成など、すべての細胞機能において主要な役割を果たしています。タンパク質は、他の分子と物理的に相互作用することによってその機能を媒介します。タンパク質間相互作用(PPI)は、シグナル伝達の媒介、環境の感知、エネルギーの身体運動への変換、代謝酵素やシグナル伝達酵素の活性の調節、^{細胞組織の維持}など、細胞機能を媒介するために重要です1。このように、PPIは未知の関数を解明するために利用できる²。PPIの検出方法は、 in vitro、 in vivo、 in silicoの3種類に分類できます。 in vitro PPI^検出には、共免疫沈降(co-IP)、アフィニティークロマトグラフィー、タンデムアフィニティー精製、タンパク質アレイ、ファージディスプレイ、タンパク質フラグメント相補、X線結晶構造解析、および核磁気共鳴分光法が使用されています3。これらの方法の中で、co-IPはそのシンプルさから広く使用されています。

融合タグFLAGは、エンテロキナーゼ切断部位を含む8つのアミノ酸(AspTyrLysAspAspAspAspLys:DYKDDDDK)からなり、免疫親和性クロマトグラフィー^....

プロトコル

図 1 は、プロトコルの概要を示しています。

1. 溶液と緩衝液の調製

1. タンパク質溶解バッファー:以前に発表されたレポート⁷ (表1)に従って、タンパク質溶解バッファーを調製します。
2. タンパク質溶解バッファー + プロテアーゼ阻害剤(PI):上記の調製したバッファーにプロテアーゼ阻害剤( 材料の表を参照)を添加します(ステップ1.1)。-20°Cで保存してください。
3. サンプルバッファー:4x Laemmli サンプルバッファー 900 μL ( 材料表を参照) と 2-メルカプトエタノール 100 μL を混合します。-20°Cで保存してください。
4. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)とポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(PBS-P):1.998 LのPBSと2 mLのポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレートを混合します( 材料の表を参照)。室温で保存してください。
5. 1x Tris/Glycine/SDS緩衝液: 450 mLの重水素減少水と50 mLの10x Tris/Glycine....

ディスカッション

このプロトコルは、以前に報告されたプロトコル^5,7,14,15とほぼ同じです。このプロトコルの重要なポイントは、細胞溶解ステップから免疫沈降ステップまで実験を決して停止しないことです。タンパク質分解はPPI検出を妨げます。長時間の経過と凍結融解のサイクルを繰り返すと、タンパク質が?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH8.0)	Nippon gene	311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL	Biorad	4561034
10x Tris/Glycine/SDS	Biorad	1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep	GE Healthcare	NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey	GE Healthcare	NA934-1ML
Cell Scraper M	Sumitomo Bakelite	MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm	IWAKI	4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Invitrogen	10565042
D-PBS (-)	FUJIFILM Wako	045-29795
Glycerol	FUJIFILM Wako	072-00626
Glycine	FUJIFILM Wako	077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724	Cell Signaling	C29F4
Laemmli Sample buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Biorad	7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels	Biorad	1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma	F3165
NaCl	FUJIFILM Wako	191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16	This paper	N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1	This paper	N/A
pcDNA3.1-vector	This paper	N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride	PSI	24765
Penicillin-streptomycin solution	FUJIFILM Wako	168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	FUJIFILM Wako	168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako	167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs	Cytiva	17061801
Protein LoBind Tubes	eppendorf	30108442
ROTATOR RT-5	TAITEC	RT-5
skim milk	Morinaga	0652842
Stripping Solution	FUJIFILM Wako	193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack	Biorad	1704156B03
Trans-Blot Turbo System	Biorad	N/A
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30910.03
Veriblot	Abcam	ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970	Cell Signaling	4970S