良性胃体および外皮上皮の生検からの患者由来胃オルガノイドの確立と特性評価

要約

胃患者由来オルガノイドは研究での利用が増加しているが、標準化された播種密度を持つ単一細胞消化物からヒト胃オルガノイドを生成するための正式なプロトコルが不足している。このプロトコルは、上部内視鏡検査中に得られた生検組織から胃オルガノイドを確実に作成するための詳細な方法を提示します。

要約

胃患者由来オルガノイド(PDO)は、胃の生物学と病理学を研究するためのユニークなツールを提供します。その結果、これらのPDOは、幅広い研究用途での使用が増加しています。しかし、標準化された初期細胞播種密度を維持しながら、単一細胞消化物から胃PDOを産生するための公表されたアプローチは不足しています。このプロトコルでは、重点は隔離された単一細胞からの胃のオルガノイドの開始および分裂によってオルガノイドを継代の方法の提供にある。重要なことに、このプロトコルは、最初の細胞播種密度への標準化されたアプローチが、良性の生検組織から胃オルガノイドを一貫して生成し、オルガノイド増殖の標準化された定量化を可能にすることを示しています。最後に、胃PDOは、オルガノイドが体の生検に由来するか、胃の胞状領域に由来するかに基づいて、さまざまな形成速度と増殖速度を示すという新しい観察結果を裏付ける証拠があります。具体的には、オルガノイド開始に門生検組織を使用すると、胃本体の生検から生成されたオルガノイドと比較して、より多くのオルガノイドが形成され、20日間にわたってオルガノイドの成長が速くなることが明らかになりました。本明細書に記載されているプロトコルは、研究者に胃PDOを正常に生成および操作するためのタイムリーで再現性のある方法を提供します。

概要

オルガノイドは、オルガノイドの元となった器官の構造や機能に似た、ミニチュアの3次元(3D)細胞構造です^1,2。これらのラボで培養されたモデルは、幹細胞または組織特異的細胞を制御された環境で培養することによって作成され、これらの細胞が自己組織化してさまざまな細胞型に分化できるようにします^1,2,3。オルガノイドの主な利点の1つは、従来の2次元(2D)細胞培養よりもヒトの生物学をより詳細に再現できることです^1,2,3。特に、ヒトオルガノイドは、その起源組織の遺伝的多様性を維持することが示されている^3,4,5。オルガノイドは、ヒトの臓器発生を研究し、疾患をモデル化し、制御された実験室環境で潜在的な治療法をテストするユニークな機会を提供します。さらに、オルガノイドは個々....

プロトコル

このプロトコルで利用されるすべてのヒト組織は、ペンシルベニア大学治験審査委員会(IRB#842961)によって承認された胃組織収集研究を通じて、組織収集にインフォームドコンセントを提供した個人から収集されました。この研究の参加者は、日常的なケアの一環として上部内視鏡検査を受け、18歳以上であり、インフォームドコンセントを提供できる必要がありました。実施されたすべての研究は、ペンシルベニア大学が定めたガイドラインに準拠しています。

1. 実験準備

1. 前述のように、コンディショニングされたL-WRNメディアを準備します¹⁶.必須ではありませんが、コンディショニング培地に含まれるWnt-3A、R-spondin、およびnogginの濃度は、メーカーの指示に従って市販のELISAキットを使用して確認できます( 材料表を参照)。
2. RPMI-抗生物質(RPMI-ABX)、PBS-抗生物質(PBS-ABX)、PBS-ジチオスレイトール(PBS-DTT)、消化バッファー、および胃オルガノイド培地を調製します(詳細な組成については 補足表1 を参照)。胃オルガノイド培地は4°Cで1週間安定です。
3. オートクレーブ鉗子、細かい解剖ハサミ、1.5 mLチューブ。
4. 基底膜マトリ....

ディスカッション

本明細書では、胃本体および前庭部からの良性上皮の生検から単離された単一細胞からヒト胃オルガノイドを確実に生成するための詳細なプロトコルが概説される。プロトコルの重要なステップは、タイミングと基底膜マトリックスの取り扱いを中心に展開します。生存率を維持するためには、生検組織を取得した後、できるだけ早くプロトコルを開始することが不可欠です。目的は、生検?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503