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要約

ここでは、ナノ秒パルス電場(nsPEF)を印加してin vitroでシュワン細胞を刺激するためのプロトコルを紹介します。関連する因子の合成能力と分泌能力、および細胞の行動変化により、nsPEFを使用した刺激の成功が検証されました。この研究は、末梢神経再生法について肯定的な見方を示しています。

要約

シュワン細胞(SC)は、末梢神経系の髄鞘細胞であり、末梢神経の再生に重要な役割を果たしています。ナノ秒パルス電界(nsPEF)は、神経電気刺激に適用可能な新しい方法であり、細胞増殖やその他の生物学的プロセスを刺激するのに効果的であることが実証されています。nsPEFの下でSCが有意な変化を経験するかどうかを評価し、新しい末梢神経再生法の可能性を探るのに役立つことを目的として、培養されたRSC96細胞を5 kVおよび10 kVでnsPEF刺激にさらした後、3〜4日間培養を続けました。その後、特定のマーカータンパク質、神経栄養因子、転写因子、および髄鞘形成調節因子を含む、SCによって発現されるいくつかの関連因子を評価して、成功した刺激を実証しました。代表的な結果は、nsPEFがSCの増殖と移動、および末梢神経の再生に積極的に寄与する関連因子を合成する能力を有意に増強することを示しました。同時に、GFAPの発現が低いことは、末梢神経損傷の良性の予後を示していました。これらの結果から、nsPEFはSCを刺激することにより末梢神経損傷の効率的な治療法として大きな可能性を秘めていることが示されました。

概要

毎年、何百万人もの人々が末梢神経系(PNS)と中枢神経系(CNS)の両方が関与する神経損傷に罹患しています1。研究によると、神経損傷後の CNS の軸索修復能力は非常に限られていますが、PNSは SCs 2 の大幅な可塑性により能力が向上していることが示されています。それにもかかわらず、末梢神経損傷後に完全な再生を達成することは依然として困難であり、人間の健康に重大な課題をもたらし続けています3,4。今日では、自家移植片は、ドナー部位の罹患率と利用可能性が限られているという欠点にもかかわらず、一般的な治療法であり続けています5。このような状況により、研究者は材料6、分子因子7、電気刺激(ES)などの代替療法を探求するようになりました。軸索の成長と神経再生を促進する因子として8、適切なESの方法を選択し、ESとSCの関係を探ることが不可欠となる。

SCはPNSの主要なグリア細胞であり、PNS9,10の再生に重要な役割を果たしています。末梢神経損傷後、SCは急速な活性化、広範な再プログラミング2、およびミエリン形成状態から成長支持形態への移行を経て、神経の再生2を行います。SCの実質的な増殖は、損傷した神経の遠位端で発生しますが、遠位断端のSCは増殖と伸長を受けてBungnerバンドを形成します。これは、軸索を標的臓器に向かって成長させるのに必要です11。さらに、近位および遠位の神経断端からのSCは、神経橋に移動して軸索再生を促進するSCコードを形成します12。さらに、これまでの研究では、転写因子13、神経栄養因子14、髄鞘形成制御因子13など、末梢神経再生の場合、SCに関連する関連因子の合成と分泌が変化することが示されています。これらに基づいて、末梢神経再生を改善するために、SCの増殖、移動、合成、および関連因子の分泌の促進が広く研究されてきた15。

これまでの研究では、ESを神経再生に利用できる可能性が示されています1。ESは、これらの生体分子の電荷分布を変化させることにより、細胞膜の脱分極を誘導し、膜電位を変化させ、膜タンパク質の機能に影響を与えることができるというのが広く受け入れられている説明です1。ただし、広く適用されているインテンスPEFは、激しい痛み、不随意の筋肉収縮、および心臓細動を引き起こす可能性があります8。また、クレアチンキナーゼ(CK)の活性を増加させ、筋力を低下させ、遅発性筋肉痛(DOMS)の発症を誘発します16。nsPEFは、ナノ秒のパルス幅内で高電圧電界で被験者を刺激する新しい技術であり、細胞レベルの研究で徐々に使用されています17,18。以前の研究では、細胞増殖と細胞小器官の活性を促進するnsPEFの可能な理論的根拠は、膜ナノポアの形成とイオンチャネルの活性化であり、それが細胞質Ca2+濃度の増加につながると報告されています19。nsPEFは、パルスパワー技術を利用して細胞膜を充電し、短時間、急速な立ち上がり時間、高出力、および低エネルギー密度を特徴とするパルスを生成する20。これらの特性は、nsPEFが刺激の副作用が最小限に抑えられた好ましいモードである可能性があることを示唆しています8。さらに、nsPEFは、外科的介入と比較して、低侵襲手術、可逆性、調整性、神経組織への非破壊性などの利点を提供します。生物医学分野におけるnsPEFの主流の研究方向性の1つは、高エネルギー電界刺激21,22,23を使用した腫瘍組織アブレーションへの応用です。いくつかの研究結果は、12-nsPEFが損傷を引き起こさずに末梢神経を刺激できることを示しています24。しかし、現在のところ、神経再生の分野でのnsPEFの適用に関する証拠は限られています。また、nsPEFを用いてSCを刺激することは、先駆的な試みであり、さらなるin vivoおよび臨床研究に貢献しています。この研究では、SCのnsPEF刺激が神経再生を促進し、その後の深く体系的な研究に信頼できる基盤を提供できるかどうかを調査しています。

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プロトコル

1. 凍結保存されたRSC96細胞の解凍

  1. 1 mLの細胞懸濁液を含むクライオバイアルを37°Cの水浴で急速に振とうして解凍し、4〜6 mLの完全培地を含む遠心チューブに加えてよく混合します。
  2. 1000 x g で3〜5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を3 mLの完全培地に再懸濁します。
  3. 細胞懸濁液を6〜8 mLの完全培地を含む培養フラスコ(またはディッシュ)に加え、37°Cで一晩インキュベートします。
  4. 翌日、顕微鏡で細胞の成長と密度を観察します。

2.細胞継代:

注:細胞密度が80%〜90%に達すると、継代の準備が整います。

  1. 培地を廃棄し、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を1〜2回すすぎます。
  2. 0.25%(w/v)トリプシン-0.53 mM EDTAを培養フラスコ(T25フラスコの場合は1〜2 mL、T75フラスコの場合は2〜3 mL)に加え、37°Cで1〜2分間インキュベートします。
  3. 細胞の剥離を顕微鏡で観察します。ほとんどの細胞が丸くなって分離した場合は、フラスコをすぐに作業領域に戻し、フラスコを軽くたたいて、10%FBSを含む3〜4mLの培地を加えて消化を停止します。
  4. 内容物を混合し、溶液を吸引し、1000 x g で5分間遠心分離します。次に、上清を捨て、1〜2 mLの新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁し、穏やかにピペッティングします。
  5. 細胞懸濁液を新しいT25フラスコに1:2の比率で移し、7 mLの培地を加えます。

3. nsPEFデバイスの操作

  1. RSC96細胞を1 mLのDMEM培養培地に再懸濁し、両側に電極がある比色皿に移します。
  2. 電源スイッチを入れます。
  3. 機器のノブを回してパラメータを調整し、電界の強度を変更します。この研究で設定された強度は、5 kV/cm、10 kV/cm、20 kV/cm、および 40 kV/cm です。
  4. 火花が現れるまで電極を慎重に回転させ、セルがプリセットされた電界強度強度に従って5パルスのnsPEFを受け取ることができるようにしてから、すぐに2つの電極を分離します。この処理後、nsPEFで処理した実験群細胞と未処理の対照群細胞を、一定期間(この実験では1日)の細胞培養後に、それぞれセクション4-6を行います。

4. Cell Counting kit-8 (CCK-8) assay

  1. 電気刺激で刺激されたRSC96細胞から特定の濃度の細胞懸濁液を調製します。100 μLの細胞懸濁液を96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに加えます。CCK-8アッセイの要件を考慮して、試薬キット内の細胞の総数を1 x 103 から1 x 106の間で制御します。
  2. キットから10 μLのCCK-8溶液を取り出し、96ウェル細胞培養プレートに加えます。CO2 インキュベーターで37°Cでさらに30分から4時間インキュベートします。
  3. 吸光度を測定します。検出波長430-490nm、基準波長600-650nmの2波長測定をご使用ください。
  4. 細胞増殖の実験結果に基づいて、後続の実験の電界強度強度を決定します。その後の実験のために、増殖が良好な細胞を選択します。

5. セルスクラッチアッセイ

  1. 6ウェルプレートの各ウェルに、ウェルあたり総容量2 mLの3 x 105 細胞を播種します。約72時間後、細胞はウェルを覆います。実験群と対照群で別々にテストを実施します。
  2. ピペットチップを使用して、培養ウェルの底に水平線を引きます。ピペットの先端が垂直に保持されていることを確認し、傾けないようにしてください。
  3. 培地を吸引し、PBSで2〜3回洗浄します。
  4. 各ウェルに2 mLの無血清培地を加えます。
  5. プレートを37°Cインキュベーターに入れます。倒立顕微鏡の4倍倍率で0時間および24時間で写真を撮り、細胞移動の変化を観察します。

6. 免疫蛍光

  1. 細胞透過化:
    1. 細胞懸濁液を培養皿に静かにピペッティングした後、カバーガラス上に細胞が均一に分布している位置に組織学ペンで円を描きます。対照群と異なる実験群を別々に扱います。
    2. 50-100 μLの透過処理作業溶液(0.25-0.5% Triton X-100)を加え、室温(RT)で20分間インキュベートします。毎回5分間、PBSで3回洗浄します。
  2. 血清ブロッキング:円内に3%のBSAを添加して、組織を均一に覆います。室温で30分間インキュベートします。
  3. 一次抗体のインキュベーション:ブロッキング溶液を静かに除去し、適切に希釈した一次抗体(マウス由来、1:300で希釈)を細胞ウェルに加えます。細胞培養プレートを湿った箱に入れ、4°Cで一晩インキュベートします。
  4. 二次抗体インキュベーション:細胞プレートをシェーカーに置き、毎回5分間、3回洗浄します。対応する二次抗体(CY3標識ヤギ抗マウスIgG、1:300に希釈)を添加し、室温で50分間インキュベートします。
  5. DAPI核染色:
    1. カバーガラスをPBS(pH 7.4)に入れたシェーカーに置き、毎回5分間3回洗います。
    2. スライドを穏やかに乾燥させた後、DAPI染色溶液(2 μg/mL、1円あたり0.5 mL)を円の中に加え、室温で暗室で10分間インキュベートします。
  6. 取り付け:カバーガラスをPBS(pH 7.4)に入れたシェーカーに置き、毎回5分間3回洗います。スライドを穏やかに乾燥させた後、蛍光を発するために退色防止封入剤でカバーガラスを密封します。
  7. 画像取得:330〜380 nmの波長でDAPIを励起し、420 nmで発光を検出します。AF488については、465〜495nmで励起し、515〜555nmで発光を検出します。510-560 nmで励起し、CY3について590 nmで発光を検出します。608-648 nmで励起し、CY5について672-712 nmで発光を検出します。

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結果

低強度パルス電界が細胞増殖を刺激する
CCK-8アッセイによると、5 kV/cm群のRSC96の増殖速度は、対照群の細胞よりも有意に速かった。しかし、パラメータが増加(20kV/cmおよび40kV/cm)すると、増殖速度は不安定になり、対照群よりもさらに低くなっていました。RSC96細胞の細胞増殖速度は、40 kV/cm群の対照群および5 kV/cm群よりも有意に低く、有意な統計的差(P < 0.05)を示しました。細?...

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ディスカッション

近年、nsPEFの適用は、報告されているように、成長を後押ししています。nsPEFは、所望の領域のみに高度に的を絞った効果を有し、追加の熱損傷を引き起こすことなく治療するのに十分なエネルギーを提供し、人体にとってより安全なものとなる28。これらの特性により、腫瘍治療と神経再生における有望なトランスレーショナルな見通しが得られます。しかし、いくつかの?...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、National Key Scientific Instrument and Equipment Development Project(NO.82027803)の資金提供を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Antifade mounting mediumWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1401
Anti-GFAP Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB14146-100
BSAWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGC305010
CoverslipJiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgGWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB21302
DAPI Staining ReagentWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1012
Decolorizing shakerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDDS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEFMatsusada Precision Inc.AU-60P1.6-L
Histochemical penWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6100
Membrane breaking liquidWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1204
Microscope slideWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6012
Palm centrifugeWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMS6000
PBS powderedWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG0002
PipetteWuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscopeNikon, JapanNIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibodyBeijing Bioss Biotechnology Co., LTDBS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cellsWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDSTCC30007G-1
scanister3DHISTECHPannoramic MIDI
Special cable for nsPEFTimes Microwave SystemsM17/78-RG217
Turbine mixerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMV-100

参考文献

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