ウサギの眼全体の高品質な凍結切片の取得

要約

このプロトコルは、ウサギの眼全体の高品質な凍結切片を得るための信頼性の高い方法を説明しています。ウサギの眼の解剖、固定、埋め込み、および切片化の手順を詳しく説明しており、より大きな眼の免疫組織化学を利用するあらゆる研究での使用に容易に適応できます。

要約

このプロトコルは、ウサギなどの大型動物で高品質の網膜凍結切片を取得する方法を説明しています。除核後、眼を固定剤に短時間浸します。次に、角膜と虹彩を切除し、眼球を一晩放置して4°Cでさらに固定します。 固定後、レンズを取り外します。次に、眼球をクライオモールドに入れ、埋め込み培地で満たします。レンズを取り外すことにより、埋め込み媒体は硝子体へのアクセスを改善し、網膜の安定性を向上させます。重要なことに、眼は硝子体全体に完全に浸透できるように、埋め込み培地で一晩インキュベートする必要があります。一晩のインキュベーション後、眼をドライアイスで凍結し、切片化します。全網膜切片は、免疫組織化学で使用するために得ることができる。標準的な染色プロトコルは、網膜組織内の抗原の局在を研究するために利用できます。このプロトコルを順守することで、免疫組織化学を利用するあらゆる実験で使用できる高品質の網膜凍結切片が得られます。

概要

網膜は、眼内の特殊な細胞のいくつかの層で構成されており、それらが一緒になって光を神経信号に変換する働きをします。網膜は視力において重要な役割を果たしているため、その構造と機能を理解することで、黄斑変性症や糖尿病性網膜症など、視力喪失の最も一般的な原因のいくつかについて貴重な洞察を得ることができます。

ウサギは、他のモデルと比較していくつかの利点を提供するため、網膜研究において便利な動物モデルとして機能します。ウサギの目は、解剖学的構造が人間の目と比較的似ています^1,2。例えば、ウサギには、ヒトの中心窩に類似した、水平視覚筋として知られる視細胞密度の増加した領域があります。げっ歯類などの他の一般的に使用される動物モデルには、解剖学的同等物がありません。さらに、げっ歯類と比較して、ウサギの網膜血管系はヒトのそれとかなり似ています。ウサギの目も比較的大きいです。これにより、硝子体または網膜内での薬物投与または外科的介入を含む研究に特に適しています^が、これは小さな眼では困難または不可能である可能性があります3。

免疫組織化学(IHC)は、組織内の抗原の局在を研究するために広く使用されている手法であり、網膜研究に広く応用されています^4,5,6。網膜はデリケートな構造であるため、IHCで有用な結果を得るには、慎重な組織処理が必要です。網膜剥離や、網膜の破損や襞などのその他の組織アーチファクトは、通常、処理中に発生し、結果の解釈を妨げる可能性があります。プロセシングが成功するかどうかは、組織の操作、固定の種類と持続時間、埋め込み培地の種類、切片化技術など、さまざまな要因に左右されます7,8,9,10。網膜研究においてウサギを動物モデルとして使用する利点にもかかわらず、ウサギ網膜の組織処理が成功したことを示すプロトコルはほとんど存在しません。この論文では、IHCで使用するためにウサギの眼全体から高品質の網膜切片を得るための信頼性の高い方法について説明します。

プロトコル

すべての手続きは、南カリフォルニア大学の動物管理・使用委員会(IACUC)に準拠し、承認されて実施されました。生後4ヶ月から6ヶ月の14匹(n = 14)のオランダベルト付きウサギが、このプロトコルの開発に使用されました。オスとメスの両方の動物が使用されました。すべての動物の体重は2.0〜2.5kgでした。すべての動物は一人で飼われていました。推奨される材料と機器のリストは、 材料の表にあります。

1. 事前準備

1. 固定剤の調製。
   1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製します。最低でも、片眼あたり50mLの固定剤が必要です。
2. 凍結保護剤の調製。
   1. PBSで30体積重量(w / v)スクロースを調製します。ショ糖が完全に溶解していることを確認するために、シェーカーに少なくとも15分間置きます。最低でも、片眼あたり50mLの凍結保護剤が必要です。
3. 解剖器具の準備。
   1. 鉗子2対、湾曲ハサミ1対、メス刃1枚、100mm解剖皿を集めて、解剖顕微鏡の近くに置きます。セットアップの例を 図 1A に示します。

2. 初期固定

1. 経結膜核摘出^術11の後、直ちに氷上のPBS中の少なくとも50 mLの4%PFAに眼を置きます。目が完全に水没していることを確認してください。目の外面に気泡が溜まった場合は、軽く振って気泡を取り除いてください。

3.角膜と虹彩の除去

1. 15分後、PBS中の4%PFAから眼を取り出し、解剖顕微鏡下の100 mm解剖皿に入れます。目が乾くのを防ぐために、皿にPBSを入れます。
2. 角膜を取り外します。
   1. まず、下層部の構造に誤って穴を開けないように、虹彩面と平行に、輪部の前方1 mmに外科用ブレードで切開を作成します(図1B)。
   2. 最初の切開部に湾曲したハサミを挿入し、リンバスから1mm離れたまま円周方向に切断を続けます。鉗子を使用して、切断中に目を安定させます(図1C)。
   3. 円周方向のカットが完了したら、鉗子で角膜を取り外し、ラボラトリーワイプで余分なPBSをやさしく拭き取ります。角膜を室温(RT)の30%ショ糖溶液に入れて、凍結保護または廃棄します。.凍結保護は、角膜が沈むと完了し、通常は1時間未満で完了します。
3. 虹彩を取り外します。
   1. 虹彩を通して湾曲したはさみで最初のカットを行うことから始めます。角膜の除去と同様に円周方向に切断することにより、虹彩を組織の他の部分から完全に分離します(図1D)。
   2. 円周方向のカットが完了したら、鉗子で虹彩を取り外し、実験室のワイプで余分なPBSを優しく拭き取ります。アイリスをRTの30%スクロース溶液に入れて凍結保護するか、上記のように廃棄します。.凍結保護は、虹彩が沈むと完了し、通常は30分未満で完了します。

4. 固定完了

1. 角膜と虹彩を取り除いた状態で、PBSで調製したばかりの4%PFAの少なくとも50 mLに目を入れ、シェーカーに乗せて穏やかに攪拌します。攪拌中は目が水没したままであることを確認してください。
2. PBS中の4%PFAに4°Cで一晩目を保ちます。
   注:4% PFAは、4°Cで16時間から24時間の間に使用すると優れたIHC染色をもたらし、固定時間が長くなると非特異的バックグラウンド染色とエピトープマスキングが増加することがわかりました。

5.レンズの取り外し

1. 翌朝、PBS中の4%PFAから眼球を取り出し、解剖顕微鏡下の100 mm解剖皿に入れます。目が乾くのを防ぐために、皿にPBSを入れます。
2. レンズを取り外します。
   1. 鉗子で前水晶体嚢を慎重につかむことから始めます。
      注意: 鉗子でレンズを強く押したり引いたりしないように細心の注意を払ってください。
   2. はさみを後房に慎重に挿入し、ブレードをレンズに沿って後方に湾曲させます。湾曲したハサミで水晶体小帯に最初のカットを入れます。
      注意: はさみで小帯を強く押したり引いたりしないように細心の注意を払ってください。これは、網膜の剥離を引き起こす可能性があるためです(図1E)。
   3. 円周方向にレンズ小帯に小さな切り込みを入れ続けます。クロック時間あたり3〜5カットします。
   4. 水晶体が組織の他の部分から分離しているかどうかを確認するには、鉗子で前水晶体嚢をそっとつかみ、そっと持ち上げてみてください。レンズがすぐに浮かばない場合は、網膜剥離を引き起こす可能性があるため、さらに引っ張ろうとしないでください。代わりに、残りの水晶体小帯をさらにカットして再試行します。
   5. 組織の他の部分から分離したら、凍結保護のためにレンズをRTの30%スクロース溶液に入れるか、上記のように廃棄します。凍結保護は、レンズが沈むと完了しますが、通常は数時間かかります。
3. 凍結保護のために、4°CのPBS中の30%スクロースを少なくとも50mLに入れます。凍結保護は、目が沈むと完了しますが、通常は24〜48時間かかります。凍結保護を迅速に行うには、8〜12時間後に最初のショ糖溶液を新しいものと交換するか、RTのショ糖溶液に目を留まらせてください。

6. 埋め込み

1. 凍結保護が完了したら、30%ショ糖溶液から眼を取り出し、解剖顕微鏡下の100mm解剖皿に入れます。目を慎重に裏返して下を向くようにし、目の内側から余分なショ糖溶液を取り除きます。
   注:ワイプが硝子体に付着して網膜剥離を引き起こす可能性があるため、実験室のワイプで目の内側から余分な溶液を取り除こうとしないでください。
2. 目を下に向けて、ワイプを使用して目の外側部分から余分なショ糖溶液をやさしく拭き取ります。
3. 使い捨ての埋め込み型に、最適な切断温度(OCT)コンパウンドを0.5〜1.0cmの深さまで充填します。
   注:このベースは、目が金型の底に触れないようにし、後で凍結切片化を妨げます。
4. 上を向いて使い捨ての埋め込み型に目を置きます。目の内側をOCTでゆっくりと満たし、目内に泡が形成されないように特別な注意を払います。気泡が発生した場合は、気泡を慎重に取り除くか、鉗子を使用して型の端に押し込みます。
5. 使い捨て埋め込み型にOCTを充填し、目が完全にOCTに沈み、金型の内面に触れたり、空気にさらされたりしていないことを確認します。OCTで目を含む使い捨ての埋め込み型をパラフィルムで包みます。4°Cで一晩置きます。
   注:私たちの経験では、潜伏期間が短いと、OCTが硝子体に完全に浸潤することはできません。その結果、スクロースの層が網膜とOCTの間に残ることがよくあります。これが発生すると、凍結ショ糖は凍結OCTよりも構造的支持が少ない可能性が高いため、凍結切片中に網膜が他の組織から剥離したり、完全に引き裂かれたりすることが多く、高品質の切片を取得することが困難または不可能になります。
6. 翌朝、OCTの眼を含む埋め込み型を100 mmの解剖皿に、解剖顕微鏡下に置きます。後部の硝子膜が内側の網膜から上向きに浮き上がっているように見えることを確認します。
   注意: この上向きの持ち上げは、網膜の視界を遮り、向きを決定するのを困難にする可能性があります。
7. 目の向きをよりよく判断するには、後部の硝子膜を前方に注意深くつかみ、OCT中に鉗子でそれを剥がして下にある網膜を露出させようとします。
   注:時々、視神経乳頭に付着する硝子管が見える場合があり、視神経乳頭が網膜の上部に位置しているため、配向目的で使用できます(図2A)。OCTはすでに硝子体に浸潤して内側の網膜を覆っており、残りの膜は凍結切片に影響を与えないため、後部硝子膜を完全に除去する必要はありません(図2B)。後部硝子膜は、必要な場合にのみ向きを合わせるために除去する必要があります。向きを決定するための他のオプションには、核摘出前に縫合糸または他の種類のマークを配置することが含まれます。
8. 新しいOCTを0.5〜1.0 cmの深さまで充填した新しい埋め込み型に目を移し、手順6.3〜6.5のように新しいOCTを充填して、最終的な埋め込み媒体に一晩で蓄積した可能性のある破片やその他の欠陥がないことを確認します。可能であれば、OCTも目の内側からワイプでそっと取り除きますが、これは必須ではありません。
9. 向きの目的で金型にラベルを付けます(図2C)。クライオモールドで目を上に向けて目を向けると、OCTが内側の網膜を裏打ちすることが保証されます。視神経乳頭に付着する硝子管は、眼の上部分を決定するための重要な目印です(図2A)。
10. OCTの目が入ったラベル付きの埋め込み型をドライアイスの上に置きます。目が埋め込み金型の内面に触れたり、空気にさらされたりしていないことを確認してください。金型がドライアイスに直接触れていることを確認して、凍結プロセスをスピードアップします(図2D)。
11. 埋め込まれたアイを-80°Cの冷凍庫に移すか、直接クライオスタットに移して切片化します(図2E)。

7.クライオセクショニング

1. 目の上部が上を向き、目の下部が下を向くようにブロックを取り付け、残りの角膜と虹彩を右( 図2Eなど)または左(図示せず)に向けます。または、必要に応じて、ブロックを別の向きで取り付けます。必要に応じて、型の各側面を一度に1つずつ慎重に壊し、目の向きを失わないようにブロックに直接印を付けることにより、型を壊してブロックを動員します。
2. ブロックをクライオスタット内の温度に30〜60分間平衡化させます。-20°Cは良い出発点です。
3. 取り付けたら、新しいブレードを目的の角度(通常は目の垂直軸に平行)に配置します。
4. 必要に応じてセクションの厚さを設定します:厚さ10〜20μmのセクションが適切な出発点です。厚さ14μmの切片の例を図3A-Cに示します。
   1. ゆっくりと制御された方法で、ブロックの断面化を開始します。ブレードが目の垂直軸に平行にブロックを切断していることを確認します。そうでない場合は、ブレードがブロックまたはステージの向きに接触する角度を調整します。
   2. ブロックを切片にするときは、ブラシで切片のしわやカールを防ぎます。切片をすばやく裏返し、長毛のブラシで下に優しく圧力をかけ、切片を平らにし、しわやカールを最小限に抑えます。セクションの操作を助けるために、先のとがった先端を持つ別のブラシを作ります。
5. スライドを下向きにしてゆっくりとセクションを動かして、セクションを帯電したスライドガラスに取り付けます。取り付け中にセクションが折りたたまれたり、歪んだりしないように、スライドガラスをセクション上でそっと転がします。
   注意: スライドをセクションに直接置いたり、セクションを押し付けたりすると、セクションが損傷したり歪んだりする可能性があるため、スライドをセクションに直接押し付けないでください。
6. スライドを一晩乾燥させてから、-80°Cの冷凍庫に移すか、標準的な免疫蛍光プロトコルに直接進みます。

結果

組織処理後、標準的な免疫蛍光プロトコルを使用して、網膜内の任意の数の生物学的プロセスを調査できます。図3A-Cは、共焦点顕微鏡法で得られた網膜切片の代表的な蛍光画像を示しています。網膜切片は、前述のプロトコル¹²に従って免疫染色した。

図3A-C

ディスカッション

上記のプロトコルを実施する前は、IHCのためのウサギの眼の組織処理に一貫して困難に直面していました。マウスなどの小動物の目からいくつかのプロトコルを適応させましたが、これらが不十分な固定と組織切片の困難につながることがわかりました。ウサギの網膜の一貫性のある高品質の切片を可能にするために、いくつかの重要な考慮事項があります。

考慮すべ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)