ニワトリ胚の神経管閉鎖中の組織の機械的進化のモニタリング

要約

このプロトコルは、ニワトリ胚の神経形成中の神経板組織の機械的特性を縦断的に監視するために開発されました。これは、ブリルアン顕微鏡とステージ上のインキュベーションシステムの統合に基づいており、 卵子 培養されたニワトリ胚の神経板組織のライブ機械的イメージングを可能にします。

要約

神経管閉鎖(NTC)は、胚発生における重要なプロセスです。このプロセスの失敗は、神経管の欠損につながり、先天性奇形や死亡率を引き起こす可能性があります。NTCには、遺伝的、分子的、機械的レベルの一連のメカニズムが関与しています。近年、機械的制御はますます魅力的なトピックになっていますが、3D胚組織の機械的試験を その場で実施するための適切な技術が不足しているため、ほとんど未開拓のままです。これに対応して、私たちは、ニワトリ胚組織の機械的特性を非接触および非侵襲的な方法で定量化するためのプロトコルを開発しました。これは、共焦点ブリルアン顕微鏡とステージ上のインキュベーションシステムを統合することで実現されます。組織の力学を調べるために、事前に培養された胚を採取し、ステージ上のインキュベーターに移して ex ovo 培養を行います。同時に、神経板組織の機械的画像は、発生中のさまざまな時点でブリルアン顕微鏡によって取得されます。このプロトコルには、サンプル調製、ブリルアン顕微鏡実験の実施、およびデータの後処理と分析の詳細な説明が含まれています。このプロトコルに従うことで、研究者は発生中の胚組織の機械的進化を縦断的に研究することができます。

概要

神経管欠損症(NTD)は、胚発生中の神経管閉鎖(NTC)の障害によって引き起こされる中枢神経系の重篤な先天性欠損症です¹。NTDsの病因は複雑です。研究によると、NTCには、収束伸長、神経板の曲げ(例えば、頂端収縮)、神経襞の上昇、そして最後に神経襞の接着を含む一連の形態形成プロセスが含まれます。これらのプロセスは、複数の分子的および遺伝的メカニズムによって制御されており^2,3、これらのプロセスに異常が生じると、NTDs4,5,6が発生する可能性があります。NTC ^{3,7,8,9,10,11}の間、機械的な手がかりも重要な役割を果たしていることを示唆する証拠が増えており、遺伝子と機械的な手がかり

プロトコル

このプロトコルは、ウェイン州立大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されています。

1. 実験準備

1. 70%エタノール溶液を使用して、はさみとピンセットを洗浄および滅菌します。また、使い捨てピペットと注射器を用意してください。
2. 495 mLの脱イオン水に3.595 gのNaClを添加して洗浄培地を調製します。次に、5 mlのペニシリン-ストレプトマイシン(5 U / mL)を培地に加えます。100mmのシャーレに洗浄液を入れ、37°Cに温めます。
3. 全体の構成を示す 図1に従って培養皿を調製する。
   1. ろ紙を用意し、約17mm×20mmの長方形に切り、四隅を取り除きます。胚を固定するために、約7mm×10mmの大きさのろ紙の中心を中空にします(図1、左)。
      注:胚の収集については、ステップ2で説明します。
   2. 市販のリング(Φ = 1インチ、 材料表を参照)をフレキシブルフィルム(すなわち、パラフィンフィルム)層で取り付け、フレキシブルフィルムの中心も中空になるようにします。フィルム付きのこのリングは、胚の入った濾紙を保持するために使用さ....

ディスカッション

胚の初期発達は、外乱の影響を受けやすいです。そのため、サンプルの抽出や移送には細心の注意を払う必要があります。潜在的な問題の1つは、濾紙から胚が剥離することであり、これはビテリン膜の収縮につながり、ブリルアンイメージングの神経板の傾いたアーチファクトをもたらす可能性があります。さらに、この収縮は胚の発生を止める可能性があります。離脱を防ぐために、いく.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set