培養ディッシュコーティングのための成体ヒト線維芽細胞からの心臓細胞外マトリックスの作製

要約

成人のヒト心臓から単離された線維芽細胞をゼラチンでコーティングした皿の上でコンフルエントに培養し、心筋特異的な細胞外マトリックスを作製した。脱細胞化後、この基質は他の心臓細胞や細胞-マトリックス相互作用の培養や研究に使用できます。

要約

心筋は、心筋細胞とさらに多くの線維芽細胞で構成されており、線維芽細胞は細胞外マトリックスの生成に関与しています。心臓の発達の初期段階から生涯を通じて、正常な状態と病的な状態の両方で、細胞外マトリックスの組成は変化し、心筋の構造と機能に影響を与えます。ここで説明する方法の目的は、in vivoで心筋細胞外マトリックスを模倣して、in vitroで心臓細胞を培養するための基質(心臓ECMと呼ばれる)を得ることです。この目的のために、成人のヒト心臓から単離された線維芽細胞をゼラチンでコーティングした皿の上でコンフルエントに培養し、心筋特異的な細胞外マトリックスを作製した。その後、心線維芽細胞を除去し、沈着した心臓ECMを保存しながら、心筋特異的な細胞外マトリックスが他の細胞に及ぼす影響を研究するための基質を作製しました。重要なことは、培養皿の線維芽細胞由来コーティングの組成は、心臓から単離された線維芽細胞の生体内活性に応じて変化するため、さまざまな正常および病理学的条件での細胞-マトリックス相互作用のその後の研究が可能になります。

概要

すべての細胞は、生体内で生き残り、特定の機能を果たすことができる特殊な微小環境にあります。任意の組織内では、細胞はフィブリラタンパク質と非フィブリラタンパク質からなる細胞外マトリックス、およびグリコサミノグリカン1を豊富に含む基本物質に囲まれ^{ています。}マトリックス含有量の質的および量的変化は、細胞生物学に影響を与え、細胞増殖、アポトーシス、遊走、分化などのプロセスを制御します。したがって、さまざまな組織からの細胞のin vitro研究のために、この微小環境を再現することに努力が注がれています^2,3。

心筋は、心筋細胞と、心筋4内の細胞外マトリックスの生成と維持に重要な役割を果たすさらに大量の線維芽細胞^{で構成されています。}生涯を通じて、細胞外マトリックスの組成は、さまざまな正常因子および病理学的要因に応答して変化する可能性があります。細胞外マトリックス組成におけるこれらの修飾は、心筋⁵の構造と生体力学的特性に大きな影響を与えます。したがって、異なる年齢や病理学的状態に固有の微小環境がin vitroで....

プロトコル

心臓組織は、心臓移植を受けていた虚血性心疾患による末期心不全の患者から採取されました。実験に使用されたすべての検体は、ナポリ大学のフェデリコ2世の倫理委員会によって承認されたプロトコルに従い、ヘルシンキ宣言に概説されている原則に従って、患者の同意を得て、患者識別子なしで収集されました。本試験に使用されたすべての試薬および機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 実験の準備

1. 滅菌ツール/装置の準備:大きな手術用ハサミ1組、細い鉗子2セット、マイクロ解剖ハサミ2組、1L滅菌ボトル、500mL滅菌ボトル、および250mL滅菌ボトル。
2. 22 mm x 22 mmのカバーグラスを70%エタノールで数秒間消毒します。10mLの血清ピペットを使用してエタノールを吸引し、カバーグラスを37°Cのオーブンで乾燥させ、オートクレーブで滅菌します。
3. 市販の粉末塩を滅菌二重蒸留水に溶解します。1 Lの滅菌ボトルに0.35 gの重炭酸ナトリウム粉末を加えて、pH 7.4のハンク平衡塩溶液(HBSS)1 Lを調製します。.滅菌フードの下に0.22μmのフィルターメンブレンを使用して溶液を滅菌し、使用するまで4°Cで保存します。
4. 0.1 gのリン酸一塩基性カリウム、4.0 gの塩化ナト....

結果

培養中に置かれた天然心筋の小さな断片からの線維芽細胞の増殖は、3〜5日以内に観察されました(図1)。

その後の数日間、線維芽細胞の数は増加し続けましたが、これはおそらく心臓組織標本からの持続的な増殖と、皿表面での移動した線維芽細胞の増殖によるものです。メスによる機械的解凝集によって得られたすべて?.......

ディスカッション

ヒトの心臓サンプルから単離された線維芽細胞を21日間コンフルエントに培養して細胞外マトリックスを合成および沈着させ、培養プレートの表面にしっかりと付着する凝集層を形成しました。その後、沈着した心臓ECMを維持しながら、心筋線維芽細胞を除去することで、心筋組織内の他の細胞に対する心筋特異的細胞外マトリックスの影響を研究するための基質を?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes