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この記事について

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要約

多くの天然変性タンパク質は、多くの細胞プロセスにとって重要な行動である、非常に動的な生体分子凝縮物の形成に関与することが示されています。ここでは、生細胞内の生体分子凝縮物中でタンパク質が互いに相互作用するダイナミクスを定量化するための1分子イメージングベースの方法を紹介します。

要約

液-液相分離(LLPS)によって形成される生体分子凝縮物は、細胞組織と細胞機能の増加に重要であると考えられてきました。異常な凝縮は、がんや神経変性疾患を含む多くの疾患に関連しているため、生細胞におけるLLPSの特性評価も重要です。LLPSは、多くの場合、天然変性タンパク質間の選択的、一過性、および多価の相互作用によって引き起こされます。非常に興味深いのは、LLPSに関与するタンパク質の相互作用ダイナミクスであり、結合滞留時間(RT)、つまり凝縮物内で結合して過ごす時間の測定によってよく要約されます。ここでは、凝縮物内の特定のタンパク質の平均RTを測定できる生細胞1分子イメージングに基づく方法を紹介します。個々のタンパク質分子とそれらが結合する凝縮物を同時に可視化し、単一粒子追跡(SPT)を使用して単一分子の軌跡をプロットし、その軌跡をタンパク質と液滴の結合のモデルに当てはめて、タンパク質の平均RTを抽出します。最後に、この1分子イメージング法を適用して、オリゴマー化ドメインに融合した場合と融合していない場合のLLPS凝縮物におけるタンパク質の平均RTを比較した代表的な結果を示します。このプロトコルはLLPSに加わるあらゆる蛋白質の相互作用の原動力を測定することに広く適当である。

概要

生体分子凝縮物が細胞組織や多くの細胞機能(転写制御1,2,3,4,5、DNA損傷修復6,7,8、クロマチン組織9,10,11,12、X染色体など)に重要な役割を果たしていることを示唆する研究が増えています不活性化13,14,15、および細胞内シグナル伝達16,17,18。さらに、生体分子凝縮物の調節不全は、癌19,20,21や神経変性疾患22,23,24,25,26を含む多くの疾患に関与しています。縮合物の形成は、一過性、選択的、多価のタンパク質-タンパク質、タンパク質-核酸、または核酸-核酸相互作用によって引き起こされることが多い27。特定の条件下では、これらの相互作用は、膜のない液滴中の特定の生体分子を局所的に濃縮する密度転移である液-液相分離(LLPS)につながる可能性があります。このような多価相互作用は、タンパク質の天然変性領域(IDR)によって媒介されることが多い1,28,29。分子レベルでのこれらの相互作用の生物物理学的特徴付けは、凝縮物が広範囲に広がっていることを考えると、多くの健康な細胞機能と異常な細胞機能を理解するために重要です。共焦点蛍光顕微鏡法に基づく技術、例えば、光退色後の蛍光回収率(FRAP)30,31,32は、凝縮物と周囲の細胞環境との間の分子交換が動的であることを定性的に示すために広く使用されてきましたが、凝縮物内の特定の生体分子の相互作用動態を定量化することは、従来の共焦点顕微鏡法や単一分子では一般的に不可能です特殊なデータ解析方法のない顕微鏡検査。このプロトコルで記述されている単粒子追跡(SPT)の技術は生きているセルの単一分子の顕微鏡検査33に基づいており、凝縮物内の特定の蛋白質間の相互作用の原動力を量化する独特で強力な用具を提供する。このような測定のためのSPTの読み出しは、凝縮物中の目的のタンパク質の平均滞留時間です。

プロトコルは、データ収集とデータ解析の2つの部分に分けることができます。イメージングデータ取得の最初のステップは、HaloTag34に融合した目的のタンパク質を細胞内で発現させることです。これにより、目的のタンパク質を2つの蛍光色素で標識することが可能になり、タンパク質分子の大部分は光活性化不可能な蛍光色素(例:JFX549 Halo ligand35)で標識され、それらのごく一部はスペクトル的に異なる光活性化可能な蛍光色素(例:PA-JF646 Halo ligand36)で標識されます).これにより、細胞内のすべての凝縮物位置の同時取得と、凝縮物への結合および非結合を行う目的タンパク質の単一分子動画の取得が可能になります。一方、同じ種類の細胞は、クロマチン上でほとんど動かないヒストンであるハロタグH2Bを安定的に発現するように改変されています。次に、細胞をPA-JF646 Haloリガンドで染色し、H2Bの1分子イメージングを可能にします。以下で詳しく説明するように、この実験では、目的のタンパク質の相互作用ダイナミクスを正確に定量化するために、光退色が寄与していることが説明されています。イメージング実験用の細胞は、清潔なカバーガラス上で培養し、HaloTagリガンドで染色し、生細胞イメージングチャンバーに組み立てる必要があります。そこから、2チャンネルイメージングと1分子検出が可能な全反射蛍光(TIRF)顕微鏡で、高傾斜積層光学シート(HILO)照明下でサンプルをイメージングします。次に、発光は2つのカメラに分割され、1つは凝縮物の位置を追跡し、もう1つは単一分子を追跡します。捕捉は、自由に拡散するタンパク質をぼかし、細胞内の安定な構造に結合するために移動性の低いタンパク質のみを捕捉するために、長い積分時間(数百msのオーダー)で行われる37。

データ解析の最初のステップは、確立された単一粒子追跡(SPT)アルゴリズム38,39を使用して、映画の各フレームにおける個々のタンパク質分子を局在化し、その局在化を、その検出可能な寿命にわたる各分子の軌跡に組み立てることである。次に、軌跡は、軌跡全体の分子の局在を対応する時間におけるすべての凝縮物の局在と比較することにより、凝縮物の内部の分子を表す分子を表す分子と凝縮物の外側の分子を表す分子を表す軌道に分類されます1。

次に、生存曲線(1 - CDF)が、すべての凝縮液内軌跡の長さを使用して生成されます。分子の見かけの平均滞留時間は、生存曲線をタンパク質結合の次の2成分指数モデルに当てはめることによって抽出されます。

figure-introduction-3288,

非特異的に結合した分子の割合としてAを、非特異的に結合した分子と特異的に結合した分子の観察された解離速度をそれぞれkobs,nsおよびkobs,sとする。これ以降は、kobs,s のみが考慮されます。蛋白質の解離 ktrue と蛍光色素の光退色 kpb の両方のダイナミクスは、 k obs,s に次のように寄与します。

figure-introduction-3730;

したがって、タンパク質解離の影響を単離するために、前述の細胞株におけるH2B-Haloの特異的解離速度が測定される。

figure-introduction-3935

H2Bは、クロマチンに安定して組み込まれ、単一分子の映画取得の時間スケールで最小限の解離を経験するタンパク質である37。その比解離速度は、PA-JF646 Haloリガンドの光退色速度に等しくなります。

figure-introduction-4206.

目的のタンパク質の平均凝縮物滞留時間 は、 figure-introduction-4346次のようになります。

figure-introduction-4473.

Irgen-Gioro et al.40 の代表的な結果を示しており、オリゴマー化ドメインをIDRに融合させると、凝縮物中のIDRの滞留時間が長くなることを実証するためにこのプロトコルが適用されました。この結果は、付加されたオリゴマー化ドメインがLLPSを駆動するIDRの同型相互作用を安定化させることを示唆しています。原理的には、わずかに修正されたプロトコルを用いた同じ方法を適用して、あらゆるタイプの凝縮物の形成に関与する任意のタンパク質の同型または異型相互作用を特徴付けることができます。

プロトコル

1. 細胞内のタンパク質の標識

  1. 目的のタンパク質をHaloTagに融合させた目的の細胞株で発現させます。
  2. Haloタグ付きH2Bを1.1と同じ種類の細胞で、トランスポゾンまたはウイルス形質導入を用いて安定的に発現させる。

2. カバーガラスの作成

  1. 細胞培養にカバーガラスを使用する前に、カバーガラスを洗浄して自家蛍光汚染物質を除去してください。
    1. 直径25mm、#1.5カバーガラスをセラミック染色ラックに取り付け、ポリプロピレン容器に入れます。
    2. カバーガラスをKOHの1 M溶液に完全に浸し、1時間超音波処理します。
    3. カバーガラスを二重蒸留水(ddH2O)で3回すすぎます。
    4. カバーガラスを100%エタノールに完全に浸し、1時間超音波処理します。
    5. カバーガラスをddH2Oで希釈した20%エタノールに完全に浸し、使用するまで4°Cで保管します。

3. 顕微鏡用細胞の調製

注:細胞の汚染を防ぐために、バイオセーフティキャビネットでこのセクションの手順を実行してください。

  1. 洗浄したカバーガラスにセルをプレートします。イメージングの2日前に、ハロタグ付きタンパク質を一過性に発現させる場合は実施してください。イメージングの1日前に、ハロタグ付きタンパク質が安定または内因的に発現している場合に実施します。
    1. 滅菌鉗子を使用してカバーガラスを6ウェルプレート(細胞サンプルごとに1枚のカバーガラス/ウェル)に入れ、残留エタノールを蒸発させます。
    2. イメージング時までに70%のコンフルエントさが得られるように、各ウェルに適切な数の細胞を播種します。同じターゲットコンフルエントでH2B-Haloを安定に発現する細胞を追加のウェルに播種します。
    3. このステップは、目的のHaloタグ付きタンパク質を一過性に発現する場合にのみ実行してください。細胞を37°C、5%CO2で24時間インキュベートします。次に、適切なトランスフェクション試薬を使用し、メーカーのガイドラインに従って、目的のタグ付きタンパク質をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクションします。
    4. 細胞を37°C、5%CO2で24時間インキュベートします。
  2. 目的のHaloタグ付きタンパク質を発現する細胞を、光活性化不可能なHaloリガンド(JFX549など)と光活性化可能なHaloリガンド(PA-JF646など)の両方で染色します。H2B-Haloを発現する細胞を、光活性化可能なHaloリガンドのみで染色します。
    注:ここに記載されているハローリガンドの濃度は、出発点として使用する必要があります。最適な濃度は、目的タンパク質の発現レベルと凝縮液内局所濃度によって異なります。
    1. 目的のHaloタグ付きタンパク質を発現する各細胞サンプルについて、100 nM JFX549 Halo ligand35 および20 nM PA-JF646 Halo ligand36 を500 μLの適切な細胞培地で希釈します。H2B-Halo を発現する各サンプルについて、20 nM PA-JF646 Halo リガンドのみを 500 μL の適切な細胞培地で希釈します。
    2. 各ウェルについて、既存の培地を吸引し、2 mL の 1x PBS を添加し、PBS を吸引し(プロトコルの残りの部分では「リンス」と呼びます)、適切な Halo リガンドを含む培地と交換します。
    3. 37°C、5%CO2で1時間インキュベートします。
    4. PBS で 4 回すすぎ、Halo リガンドを含まない新しい培地と交換します。
    5. 37°C、5%CO2で15分間インキュベートします。
    6. 手順3.2.4と3.2.5を3回繰り返します(合計4回のすすぎ-インキュベーションサイクル)。
    7. 滅菌鉗子を使用して、細胞の入ったカバーガラスを顕微鏡ステージと互換性のある細胞培養カバーガラスチャンバーに移します。
    8. フェノールレッドフリー培地をチャンバーに添加し、イメージングに進みます。サンプルをすぐにイメージングせず、37°Cおよび5%CO2 で必要になるまでインキュベートします。

4. 1分子イメージング

注:H2Bと目的タンパク質の両方の滞留時間を測定する独立した実験は、統計的に有意な結果を得るために、複数(≥3)日にわたって実施する必要があります。顕微鏡で細胞サンプルをイメージングする前に、0.1 μm染色ミクロスフェア(材料表)または同様のキャリブレーション標準試料を使用して、2台のカメラの位置を合わせます。

  1. 顕微鏡を準備します。
    1. 顕微鏡と顕微鏡を制御するコンピューターの電源を入れます。
    2. 顕微鏡で生細胞インキュベーション成分(ヒーターとCO2)をオンにし、37°C、5%CO2に設定します。システムを平衡化させます。
    3. 顕微鏡の100倍TIRFオイル浸対物レンズに適切なオイルを一滴垂らし、細胞サンプルを顕微鏡ステージにロードします。
  2. イメージングする細胞を特定します。
    1. 明視野照明下で細胞サンプルを画像化し、細胞に焦点が合うまでZ位置を調整します。
    2. 健康な細胞の形態学的特徴を示す細胞を同定します。
    3. 視野角(FOV)をトリミングして、標的細胞核のみを捉えるようにします。
    4. レーザー照明を使用し、単一分子の最適な S/N 比の HILO 照明41 が得られるまで TIRF 角度を調整します。
  3. 生細胞のH2B-Haloを画像化。
    注:このセクションで使用されるレーザー出力は、この実験に固有のものであり、例として含まれています。適切なレーザー出力は、議論に記載されている基準に従って選択する必要があります。
    1. 取得構成を次のように設定します。露光時間を 500 ミリ秒に設定します。各500 ms露光中に、9.1 mW、640 nmビームで標識されたH2B-Halo分子PA-JF646を励起します。フレーム間のデッドタイム(ここで使用したイメージングシステムでは158.01μs)の間に、111 μW、405 nmのビームで分子を光活性化します。
    2. これらの設定で 2000 フレームを連続してキャプチャします。405 nmビームの出力は、光活性化分子の数が足りなくなったら、取得の過程で徐々に増やします。
  4. 生細胞で目的のHaloタグ付きタンパク質を画像化します。
    1. ロングパスダイクロイックミラーを使用して、PA-JF646とJFX549を検出する2台のカメラ間で発光波長を分割します。カメラの前で適切な発光フィルターを使用してください。
    2. 4.3.1で説明したものと同じ取得構成を使用しますが、次の変更が加えられます。JFX549チャンネルを追加して、Haloタグ付きタンパク質凝縮物の位置を経時的に追跡します。10秒ごとに、PA-JF646チャンネルの取込みを維持したまま、JFX549チャンネルの1フレーム(500ms、2.1mW、561nm励起)を取得します。これにより、PA-JF646チャンネルへのブリードスルーが発生し、取得後のデータ解析で処理されます。
    3. これらの設定で 2000 フレームを連続してキャプチャします。405 nmビームの出力は、光活性化分子の数が足りなくなったら、取得の過程で徐々に増やします。

5. 1分子イメージングデータの解析

注: セクション 5 で使用されるパラメーターは、この実験に固有のものであり、例として含まれています。適切なパラメータは、ディスカッションに記載されている基準に従って選択する必要があります。

  1. 処理する生の画像データを準備します。
    1. 目的のタンパク質のデータについては、ImageJまたは同様の画像処理ソフトウェアを使用して、生のイメージングデータファイルから独立した.tifファイルに各チャネルを変換します。H2Bのデータについても、同様に、生の画像データファイルから.tifファイルへのシングルチャンネル変換を行います。
      注:使用している集録ソフトウェアによっては、10秒ごとに1つの凝縮物トラッキングフレームしか取得されないため、コンデンセートムービーに空のフレームが存在する可能性があります。空のフレームには、最新のコンデンセートフレームが入力されます(一部の取得ソフトウェアはこれを自動的に行います)。さらに、これらの凝縮物トラッキングフレーム中に凝縮物(JFX549)チャネルから単一分子(PA-JF646)チャネルへの著しいブリードスルーがある場合は、対応する単一分子フレームを最新の単一分子フレームに置き換える必要があります。
    2. 上記の理由により、いずれかのムービーで置き換える必要のあるフレームがある場合は、必要に応じて変更し、Chong et al.1 で使用可能な ImageJ マクロである pretracking_comb.txt を実行し、プロンプトに従って、そのムービーの最新のフレームに置き換えます。
  2. SPTソフトウェア、例えば、SLIMfast39、Teves et al.42で利用可能なMTTアルゴリズム38のGUI実装を用いて、単一粒子の軌跡を生成する。
    1. Load > Imagestackをクリックして、SLIMfastの1分子動画を含む5.1.2のファイルをロードします。
    2. パラメータを設定します(ローカリゼーションエラー率:10-6;デフレループ:3)OPT > Sheet: Localizationをクリックしてローカリゼーションします。
    3. パラメータを設定します(ピーク発光:664 nm; ラグタイム:500 ms)で、 OPT > Sheet: Acquisitionをクリックして取得します。
    4. すべての分子の局在を 1 つのフレームで可視化し、選択したパラメーターが適切であることを確認します (TEST LOC)。不適切な場合は、手順 5.2.2 と 5.2.3 でパラメーターを変更し、この手順を繰り返します。
    5. すべてのフレームのすべての分子の局在を含むファイルを生成します (LOC ALL)。
    6. SLIMfast の 5.2.5 からファイルをロードするには >SLIMfast >のパーティクル データをロードします。
    7. パラメータを設定します(最大期待拡散係数:0.1 μm2/s; 最大競技者数: 5) OPT > Sheet: Tracking をクリックして軌道を生成します。
    8. すべての分子の軌跡を含むファイル(GEN TRAJ)を生成します。
  3. Drosopoulos et al.43 で入手可能な evalSPT39 を使用して、t分 (2.5 秒) より短い軌跡を除外し、人為的に短い軌跡をもたらす追跡誤差を考慮します。
    1. 5.2.8 のファイルを evalSPT にロードします (+ 5.2.8 の > ファイルを > OK) します。
    2. パラメータを設定します(最小:5フレーム; max: file from 5.2.8)を使用して、2.5秒未満の軌跡を除外します。
    3. フィルタリングされたすべての軌跡を含むファイルを生成します(EXPORT DATA)。
  4. このステップは、目的のタンパク質の軌跡についてのみ行ってください。軌跡を凝縮液内の軌跡と凝縮液外軌道に分類し、凝縮液内の平均滞留時間を抽出します。
    注: このセクションのすべてのコードは、Chong et al.1 で入手できます。
    1. JFX549 チャネルで取得したムービーのすべてのフレームをしきい値に設定して、ImageJ マクロ、核、およびクラスター mask_v2.txtを実行し、プロンプトに従って、凝縮体の位置を強調する時間発展バイナリマスクが取り込まれたタイムラプスムービーを生成します。
    2. 5.3.3で生成した1分子の軌跡を再フォーマットします。MATLAB スクリプト ConvertASCII_SlowTracking_css3.m を使用し、必要に応じてファイル名、パス、およびパラメーターを調整します。(パラメータ: 曝露、0.5秒; 解像度、0.16μm/ピクセル)。
    3. MATLAB スクリプト categorization_v4.m を使用し、必要に応じてファイル名とパスを調整し、特定の分子が凝縮物 F で費やす寿命の割合に基づいて軌跡を並べ替えます。
    4. 凝縮液内の軌跡のみを使用して続行します。
  5. kobs,s と kpb を抽出し、figure-protocol-7006補正された平均滞留時間 を計算します。
    1. MATLAB スクリプト PLOT_ResidenceHist_css.m を使用し、必要に応じてファイル名、パス、およびパラメーターを調整して、目的の凝縮物タンパク質の軌跡から kobs,s を抽出します。
      (パラメータ: 曝露、0.5秒; StartFrameForFit、5 フレーム)。
    2. MATLAB スクリプト PLOT_ResidenceHist_css.m を使用して、必要に応じてファイル名、パス、パラメーターを調整して、H2B 軌跡から kpb を抽出します。
      (パラメータ: 曝露、0.5秒; StartFrameForFit、5 フレーム)。
    3. 目的のタンパク質の凝縮物 figure-protocol-7587に特異的に結合した補正された平均滞留時間を計算します。
      figure-protocol-7706
      注:300 ms と 800 ms など、移動性粒子をぼかすのに十分な長さの異なる露光時間でも、目的のタンパク質の平均滞留時間が同じであることを確認するために、コントロールを実行する必要があります。

結果

ここでは、Irgen-Gioro et al.40 の代表的な結果を示し、この SPT プロトコルを使用して、それぞれの自己組織化 LLPS 凝縮物における 2 つのタンパク質の相互作用ダイナミクスを比較しました。TAF15(TATAボックス結合タンパク質関連因子15)には、ヒト細胞で過剰発現するとLLPSを受ける可能性のあるIDRが含まれています。我々は、24サブユニットのオリゴマーを形成するFTH1(フェリチ?...

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、Irgen-Gioro et al.40 で調査されたようなシステム向けに設計されています。アプリケーションに応じて、プロトコルの一部のコンポーネント、例えば、蛍光標識細胞株の生成方法、蛍光標識システム、および使用するカバーガラスのスタイルを変更することができます。細胞内のタンパク質のハロータグ付けは、特定の実験に適している方法に応?...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、米国国立科学財団大学院研究フェローシップ(助成金番号)の支援を受けました。DGE-1745301 (S.Y.)、Pew-Stewart Scholar Award(サウスカロライナ州)、Searle Scholar Award(サウスカロライナ州)、Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant(サウスカロライナ州)、Merkin Innovation Seed Grant(サウスカロライナ州)、Mallinckrodt Research Grant(サウスカロライナ州)、Margaret E.Early Medical Research Trust 2024 助成金 (サウスカロライナ州)。サウスカロライナ州は、NIH/NCIの賞番号P30CA016042の支援も受けています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm TetraSpeck microsphereInvitrogenT7279Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 CoverslipsMarienfeld Superior111650Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filterSemrockFF01-593/40-25Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filterSemrockFF01-676/37-25Single-molecule imaging
6-Well TC PlateGenesee25-105MPPreparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OSATCCHTB-96Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted MicroscopeNikonSingle-molecule imaging
Ethanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPreparation of coverslips
evalSPTAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
FijiAnalysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitterSemrockDi02-R635-25x36Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser UnitNikonSingle-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dishMatTekP35G-1.5-20-CPreparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-ElementsNikonSingle-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-StreptomycinGibco15-140-122Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific18912014Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.mAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium HydroxideMallinckrodt Chemicals6984-06Preparation of coverslips
pretracking_comb.txtAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfastAnalysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation systemTokai HitSingle-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitterCairn ResearchSingle-molecule imaging
Ultrasonic CleanerBranson5800Preparation of coverslips

参考文献

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