生体分子凝縮物内のタンパク質相互作用ダイナミクスの1分子測定

要約

多くの天然変性タンパク質は、多くの細胞プロセスにとって重要な行動である、非常に動的な生体分子凝縮物の形成に関与することが示されています。ここでは、生細胞内の生体分子凝縮物中でタンパク質が互いに相互作用するダイナミクスを定量化するための1分子イメージングベースの方法を紹介します。

要約

液-液相分離(LLPS)によって形成される生体分子凝縮物は、細胞組織と細胞機能の増加に重要であると考えられてきました。異常な凝縮は、がんや神経変性疾患を含む多くの疾患に関連しているため、生細胞におけるLLPSの特性評価も重要です。LLPSは、多くの場合、天然変性タンパク質間の選択的、一過性、および多価の相互作用によって引き起こされます。非常に興味深いのは、LLPSに関与するタンパク質の相互作用ダイナミクスであり、結合滞留時間(RT)、つまり凝縮物内で結合して過ごす時間の測定によってよく要約されます。ここでは、凝縮物内の特定のタンパク質の平均RTを測定できる生細胞1分子イメージングに基づく方法を紹介します。個々のタンパク質分子とそれらが結合する凝縮物を同時に可視化し、単一粒子追跡(SPT)を使用して単一分子の軌跡をプロットし、その軌跡をタンパク質と液滴の結合のモデルに当てはめて、タンパク質の平均RTを抽出します。最後に、この1分子イメージング法を適用して、オリゴマー化ドメインに融合した場合と融合していない場合のLLPS凝縮物におけるタンパク質の平均RTを比較した代表的な結果を示します。このプロトコルはLLPSに加わるあらゆる蛋白質の相互作用の原動力を測定することに広く適当である。

概要

生体分子凝縮物が細胞組織や多くの細胞機能(転^{写制御1,2,3,4,5}、DNA損傷修復^6,7,8、クロマチン組織^9,10,11,12、X染色体など)に重要な役割を果たしていることを示唆する研究が増えています不活性化13,14,15、および細胞内シグナル伝達16,17,18。....

プロトコル

1. 細胞内のタンパク質の標識

1. 目的のタンパク質をHaloTagに融合させた目的の細胞株で発現させます。
2. Haloタグ付きH2Bを1.1と同じ種類の細胞で、トランスポゾンまたはウイルス形質導入を用いて安定的に発現させる。

2. カバーガラスの作成

1. 細胞培養にカバーガラスを使用する前に、カバーガラスを洗浄して自家蛍光汚染物質を除去してください。
   1. 直径25mm、#1.5カバーガラスをセラミック染色ラックに取り付け、ポリプロピレン容器に入れます。
   2. カバーガラスをKOHの1 M溶液に完全に浸し、1時間超音波処理します。
   3. カバーガラスを二重蒸留水(ddH₂O)で3回すすぎます。
   4. カバーガラスを100%エタノールに完全に浸し、1時間超音波処理します。
   5. カバーガラスをddH₂Oで希釈した20%エタノールに完全に浸し、使用するまで4°Cで保管します。

3. 顕微鏡用細胞の調製

注:細胞の汚染を防ぐために、バイオセーフティキャビネットでこ....

結果

ここでは、Irgen-Gioro et ^al.40 の代表的な結果を示し、この SPT プロトコルを使用して、それぞれの自己組織化 LLPS 凝縮物における 2 つのタンパク質の相互作用ダイナミクスを比較しました。TAF15(TATAボックス結合タンパク質関連因子15)には、ヒト細胞で過剰発現するとLLPSを受ける可能性のあるIDRが含まれています。我々は、24サブユニットのオリゴマーを形成するFTH1(フェリチ?.......

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、Irgen-Gioro et ^al.40 で調査されたようなシステム向けに設計されています。アプリケーションに応じて、プロトコルの一部のコンポーネント、例えば、蛍光標識細胞株の生成方法、蛍光標識システム、および使用するカバーガラスのスタイルを変更することができます。細胞内のタンパク質のハロータグ付けは、特定の実験に適している方法に応?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25x36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips