実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するマウスにおける自己反応性抗体の定量化

要約

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の動物モデルであり、ヒトの疾患と強力な体液性自己免疫応答を共有しています。ここでは、EAE免疫マウスの血清中の自己抗体を定量するためのシンプルで柔軟なELISAプロトコルを報告します。

要約

実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) は、組織病理学的および分子レベルで自己免疫疾患である多発性硬化症 (MS) を再現する疾患モデルです。EAEは、短いミエリンペプチドと特異的なアジュバントを皮下注射 して 実験動物に免疫を与え、免疫応答を高めることによって誘導されます。ヒトマウスと同様に、EAEマウスは脱髄病変、中枢神経系(CNS)への免疫細胞浸潤、グリア活性化、および神経細胞損傷を発症します。一貫した一連の証拠は、MSとEAEの両方の病因におけるB細胞機能障害の機構的役割も支持しています。B細胞は、抗原提示細胞としてだけでなく、炎症誘発性サイトカインや自己抗体の主要な供給源としても機能します。EAEでは、病気を誘発するために使用されたミエリンペプチドに対する抗体が生成されます。このような自己抗体は、ミエリン喪失または病原性T細胞のCNSへの再活性化のいずれかを媒介することが示されています。この記事では、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質35-55(MOG35-55)ペプチドで免疫したC57BL/6Jマウスの血清中の自己抗体を定量するための効率的なELISAベースのプロトコルについて説明します。提案された方法は、自己免疫脱髄の文脈における異常な体液性応答の特異性と大きさを調査するための強力なツールとして機能します。

概要

多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)の慢性自己免疫疾患で、脳実質への免疫細胞の限局浸潤、軸索を包むミエリン鞘の破壊、グリアの活性化、およびニューロンの喪失を特徴とする¹。病原性T細胞の確立された役割に加えて、複数の証拠が、CNSに対する自己免疫応答の媒介におけるB細胞の関与を強調しています。B細胞はMS脳でクローン増殖を起こし、ミエリン成分に対する抗体が脱髄病変内で検出されています^2,3。疾患発症時の末梢B細胞の選択的活性化が最近文書化されており、疾患開始におけるこの免疫細胞コンパートメントの推定上の役割も示唆されています⁴。抗CD20モノクローナル抗体などのB細胞枯渇療法の成功は、異常なB細胞機能と自己免疫性脱髄との間の機構的関係をさらに裏付けています^5,6。分子の観点から、B細胞は、自己抗原の提示、炎症誘発性サイトカイン分泌、および自己反応性抗体産生を介して疾患に寄与する可能性があります。

複雑なMS表現型の特定の特徴を再現するために、複数の動物モデルが開発されています。その中でも、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、 最も広く....

プロトコル

マウスを含むすべての手順は、イーストカロライナ大学動物管理委員会(IACUC)によって承認された実験ガイドラインに準拠して実施されました。この研究では、8〜10週齢の野生型C57BL / 6J雌マウスを使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました(資料の表を参照)。EAEは、以前に発表された報告12,13,14に続いて誘発されました。

1.美容液コレクション

1. MOG35-55 免疫を介して EAE を誘導した後、必要な時点で CO₂ 窒息またはイソフルラン過剰摂取によって実験マウスを安楽死させます (施設で承認されたプロトコルに従う)。
   注:マウスの総数と血清採取の時点は、特定の実験によって異なる場合があります。
2. つま先や尻尾をつまんでバイタルサインがないことを確認したら、マウスを解剖トレイの背側横臥位にし、手足をピンやテープで固定します。マウスの体をLED光源( 材料の表を参照)に向け、動物の胸部を照らします。
3. マウスの毛皮に70%エタノールをスプレーし、解剖ハサミを使用して骨盤....

ディスカッション

ここでは、MS病理の関連する動物モデルにおける体液性反応を正確に定量化するために、シンプルで効率的なELISAベースのプロトコルが報告されました。この方法は、MOG35-55/C57BL6J EAEパラダイム¹²における自己抗体の血清レベルの制御におけるアタキシン-1タンパク質の新規の役割を説明するために最近採用されました。この点で、この方法で一貫した生物学的に意味のある結.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Biosciences	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
25 G needles	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate	Thermo Fisher	N301	Store at 4 °C
Adhesive seals	Thermo Fisher	AB0558
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906	Store at 4 °C
C57BL/6J female mice	The Jackson Laboratory	000664	Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes	Fisher	10-500-25
Dissection tray	Fisher	S111022
Dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
ELISA coating buffer	BioLegend	421701	Store at 4°C
Excel software	Microsoft		Analysis spreadsheet
Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 °C
LED light source	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
Molecular biology grade water	Corning	46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide	EZBiolab	cp7203	Store at -80 °C
Multichannel pipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Refrigerated tabletop centrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop solution	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531