水耕栽培状態における シロイヌナズ ナの根の細菌コロニー形成の測定

要約

根圏における植物成長促進根圏細菌(PGPR)のコロニー形成は、その成長促進効果に不可欠です。細菌の根圏コロニー形成の検出方法を標準化する必要があります。ここでは、根の表面での細菌のコロニー形成を定量化するための再現性のある方法について説明します。

要約

シロイヌナズナの根の細菌のコロニー形成を測定することは、植物と微生物の相互作用研究において最も頻繁な実験の1つです。根圏における細菌のコロニー形成を測定するための標準化された方法は、再現性を向上させるために必要です。まず、無菌のA.thalianaを水耕栽培状態で培養し、根圏の細菌細胞を最終濃度OD60000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000接種後2日目に、根組織を採取し、滅菌水で3回洗浄して、コロニーを形成していない細菌細胞を除去しました。次に、根の重量を量り、根にコロニーを形成した細菌細胞を渦によって収集しました。細胞懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液でグラジエントで希釈した後、Luria-Bertani(LB)寒天培地にプレーティングしました。プレートを37°Cで10時間インキュベートした後、LBプレート上の単一コロニーをカウントし、根にコロニーを形成した細菌細胞を示すために正規化しました。この方法は、単相互作用条件で根圏内の細菌のコロニー形成を良好な再現性で検出するために使用されます。

概要

単一の細菌株による根圏のコロニー形成を検出するための定量的および定性的な方法があります。定性的方法には、蛍光を構成的に発現する株を使用し、蛍光分布と強度を蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点装置^1,2で調べる必要があります。これらの戦略は、in situ³ で細菌のコロニー形成をよく反映できますが、定量化における従来のプレート計数方法ほど正確ではありません。また、顕微鏡下では部分的な根域しか表示できないという制限があるため、主観的な偏見の影響を受けることがあります。

ここでは、コロニーを形成した細菌細胞を収集し、プレート上の細菌CFUをカウントすることを含む定量的方法について説明します。この方法は、植物の根から取り除かれたコロニー化された株を数えることができ、根上のコロニー化された細菌の総数を計算することができる希釈とプレーティングに基づいています^4,5。

まず、 A. thaliana を水耕栽培条件で培養し、次いで細菌細胞を根圏に最終濃度0.01OD₆₀₀で接種した。感染した根組織は、接....

プロトコル

1.無菌水耕栽培A.thaliana栽培

1. A. thalianaの苗を準備します。
   1. 2%(wt/vol)のスクロースと0.9%(wt/vol)の寒天を含む1/2MS培地(MurashigeおよびSkoog)からなる培養 A.thaliana 苗培地を調製します。
   2. 調製した滅菌培地を滅菌正方形のペトリ皿(13 cm x 13 cm)に注ぎ、固化させます。湿度を保つために風乾は避けてください。
   3. A. thalianaの種子を、1 mLの滅菌水で満たした2 mLの微量遠心チューブに4°Cで12時間以上浸漬し、次いで種子を1 mLの2%(vol/vol)NaClOで2分間滅菌します。
   4. 種子を滅菌水で6回完全に洗浄し、NaClO溶液を除去します。滅菌チップ1mLのMS寒天培地でペトリ皿に種をまきます。
   5. 通気性のある医療用テープでシャーレを密封し、軽いインキュベーターに垂直に置いて1週間成長させます。ライトインキュベーターの昼夜比を16時間/ 8時間に設定し、温度を23°C、湿度を40%〜60%に保ちます。
2. A.thalianaを移植します。
   1. 孔径40 μmの細胞染色剤に5 mmの穴を開け、滅菌します。

ディスカッション

良好な再現性を達成するために、このプロトコルのコロニー形成検出プロセスには4つの重要なステップがあります。まず、各実験で接種した細菌細胞の数がまったく同じになるようにする必要があります。第二に、コロニー化されていない細菌の洗浄強度を滅菌水で制御することも必要です。第三に、マイクロ遠心チューブに沈みやすいバクテリアの特性による吸収誤差を避けるために、サ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E