ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

要約

本プロトコルは、高い再現性と効率で網膜オルガノイドの接着と融合を減少させる最適化された3D神経網膜誘導システムについて説明しています。

要約

網膜症は、世界中で失明の主な原因の1つです。網膜症の早期診断とタイムリーな治療には、その病因を調査することが不可欠です。残念ながら、倫理的な障壁が人間からの証拠の収集を妨げています。最近、多くの研究により、ヒト多能性幹細胞(PSC)は、異なる誘導プロトコルを使用して網膜オルガノイド(RO)に分化できることが示されており、網膜症において、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および幹細胞ベースの治療に大きな可能性を秘めています。この研究は、小胞化と融合の可能性を大幅に減らし、60日目までの産生の成功率を高める神経網膜(NR)を生成するための最適化された誘導プロトコルについて説明します。解離後にPSCが自己再編成する能力と、特定の相補的要因を組み合わせることで、この新しい方法はNRの分化を特異的に促進することができます。さらに、このアプローチは複雑で費用対効果が高く、顕著な再現性と効率を示し、網膜疾患の個別化モデルに有望な見通しを示し、細胞治療、薬物スクリーニング、遺伝子治療検査などのアプリケーションに豊富な細胞リザーバーを提供します。

概要

哺乳類^の眼では、網膜が主要な視覚感覚組織であり、ヒトの感覚器官の中では眼が主要な情報源となっている1。網膜症は、眼疾患の主要な原因の1つであり、失明につながります²。世界では約285万人が網膜症によるさまざまな程度の視力障害に苦しんでいます³。したがって、その病因を調査することは、早期診断とタイムリーな治療のために重要です。ヒト網膜症に関するほとんどの研究は、主に動物モデルに焦点を当てています^4,5,6。しかし、ヒトの網膜は、さまざまな種類の細胞からなる複雑で多層的な組織です。従来の2次元(2D)細胞培養および動物モデルシステムは、通常、天然のヒト網膜の正常な時空間発生と薬物代謝を忠実に再現することができません^7,8。

最近では、多能性幹細胞(PSC)から組織様臓器を作製する3D培養技術が進化しています^9,10。3D浮....

プロトコル

この研究は、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施され、中国人民解放軍総合病院の施設倫理委員会によって承認されました。WA09(H9)ESCラインは、WiCell研究所から入手しました。

1. 培地および試薬の調製

1. ヒトESC培地および継代溶液
   1. 維持培地(MM):500 mLの完全なMM(基礎培地+ 5xサプリメント; 材料表を参照)を無菌的に調製します。室温(RT)または2〜8°Cで一晩解凍します。 RTに予熱します。 サプリメントが曇らなくなるまで、使用前によくかき混ぜます。
   2. 1% 細胞外マトリックス(ECM):冷やしたピペットチップと滅菌チューブを使用して、チューブあたり 200 μL の ECM( 材料表を参照)を氷上に分注します。チューブは-20°Cの冷凍庫で保管してください。ECMを氷上で溶融し、予冷したDMEM/F12で1:100に希釈します。
   3. 0.5 mM pH = 8.0 EDTA:500 mL の 0.5 mM EDTA を調製するには、500 μL の 0.5 M EDTA と 0.9 g の NaCl を 500 mL の 1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に加えます( 資料表を参照)。よく混ぜて2〜8°Cで保存します。
   ....

ディスカッション

ヒトROは、胎児網膜の発達を空間的および時間的に再現することができ、初期のROは、同等の発達段階において胎児の網膜と高度の類似性を示す¹⁵。組織の形態と分子発現の点で、ヒトROは網膜組織の実際の成長状態を厳密に反映しており、疾患モデリング、薬物スクリーニング、再生医療の分野で途方もなく前例のない機会を提供します。現在、 in vitroでヒトPSCからRO.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Washing slices
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-500ML	Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318516	Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105	Fix slices
AggreWell medium	STEMCELL Technologies	5893	Medium
Anhydrous ethanol	SINOPHARM	10009218	Dehydrate
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Primary antibody
Antifade Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Primary antibody
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	Primary antibody
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Cell dissociation
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate	Gibco	12531018	250×
Citrate Antigen Retrieval Solution	Servicebio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	Cell Freezing Medium
DAPI	Roche	10236276001	Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Biosharp	BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	Corning	354277	Coating plates
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Scan sections
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates	Corning	3473
Low-adhesion 6-well Plates	Corning	3471
Maintenance medium (MM)	STEMCELL Technologies	85850	Medium
N2 supplement	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking buffer
Paraplast	Leica	39601006	Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)	Gibco	C10010500BT	Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	Key protein factor
Retinoic acid	Sigma	R2625	Powder, keep out of light
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5-inhibitor
SU5402	Selleckchem	S7667	Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurine	Sigma	T0625-10G
Thioglycerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line	WiCell Research Institute		Cell line
Xylene	SINOPHARM	10023418	Dewaxing
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor