アカントアメーバ属の定量化運動

要約

この手順では、 Acanthamoeba spp .運動。

要約

アカントアメーバ 角膜炎は、治療上の課題を引き起こし、失明につながる可能性のある重度の眼感染症です。この病原体はどこにでも存在し、水にさらされるとコンタクトレンズが汚染される可能性があるにもかかわらず、この病原体の自然な挙動はとらえどころのないままです。 アカンタメーバの動き のパターンを理解することで、アカンタメーバがどのようにコンタクトレンズにコロニーを形成し、患者の角膜を汚染するかを知ることができます。それは Acanthamoeba spp. は、4倍の倍率から始まる明視野顕微鏡で見ることができます。これまでの技術は、細胞変性の影響や電界への曝露不足に関する アカントアメー バの運動性を定量化するために開発されてきた。ここでは、 アカントアメーバ属 を追跡し定量化する方法について説明します。運動性長期(数時間から数日)は、アメーバの複数のアメーバ株、表面、および栄養状態に適用可能なプロトコルです。この手順は、感染、増殖、または行動変化のさまざまな段階を監視するために必要な、距離、速度、閉じ込め、方向性など、多くの主要な運動性の定量化を決定するのに密接に関連しています。

概要

アカントアメーバの研究は、アカントアメーバが角膜^に付着した後の寄生虫感染症であるアカントアメーバ角膜炎(AK)の有病率の増加により、近年劇的に増加しています1。AKの発生は、不適切なコンタクトレンズケアまたは効果のないコンタクトレンズケアソリューション2,3,4,5に起因する可能性がありますが、現在、市場に出回っている製品に対してアカントアメーバ消毒の有効性を実証するための要件はありません。しかし、科学界や標準化団体では、コンタクトレンズケア製品の消毒効果を定量化するために必要なプロトコルを検討するための継続的な取り組みが行われています^6,7。さらに、アカントアメーバは、細胞的および機能的側面がヒトマクロファージに類似しているため、アメーバ自体がもたらす病原性に加えて、他のヒト病原体⁸をホストし、広める上で重要な役割を果たすことが注目されています。

最近の技術は、アカントアメーバの運動性を定量化することができたと記載されている - これは一般的にブラウン運動の影響をあまり受けない ^9,10 - 細胞変性の影響や電界^9,11への曝露不足、ならびにアカントアメーバを追跡可能なウイルス^{ベクター12}として使用した巨大ウイルス研究における運動性分析の進歩に関して^、13.また、ここで使用されているイメージングソフトウェアのような新しいソフトウェアプログラムや、新しいアルゴリズムや深層学習技術¹⁴を使用して、過去20年間で細胞と粒子の追跡にも絶え間ない大幅な改善が見られました。しかし、これはベンチトップ研究、臨床応用、および工業規格に関する比較的新しく成長している科学分野であり、特にコンタクトレンズの着用後またはコンタクトレンズ消毒中または消毒後の行動変化を定量化するために、このアメーバを視覚化および追跡する方法に関するデータは不足しています。長期の目視モニタリングに拡大する他の分野も、この取り組みを支えています15,16,17。アカンタメーバは、プラスミドに対する一般的な耐性(蛍光を発する可能性がある)、アメーバが標準的な細胞色素を消費して破壊する能力、抗体の標識を困難にするユニークな外側タンパク質構成など、本質的に困難な性質を持っているため、明視野イメージング以外の設定で他の細胞がそれらを可視化する方法は、この生物では使用できませんでした。したがって、このアメーバの運動性を定量化することは、この分野への重要な追加を示しています。ここで述べた方法を用いて、アメーバは栄養素¹⁸なしで少なくとも12時間運動性を維持すること、そして消毒プロセスに挑戦して消毒中に運動性を停止したアメーバは、完全に溶解されていなくても消毒後に運動性を回復することができることを確認することができた¹⁹。

このプロトコルでは、アメーバの運動性を顕微鏡で視覚的に追跡し、定量化する方法を詳しく説明しています。主なステップは、画像間の適切な焦点とタイミングを使用して明視野でアメーバを記録し、イメージングソフトウェアを使用して画像をバイナリに変換し、イメージングソフトウェアの追跡プラグインを使用して実験パラメータを設定し、各アメーバを追跡して速度、距離、閉じ込めなどの必要な測定値を決定することです。これに続いて、方向性を定義するために、アメーバまたはアメーバ集団の走化性を定量化することが可能です。この方法の主な貢献は、栄養サポート、表面付着、消毒の課題、または哺乳類細胞培養との同居などの他の環境変化のさまざまな状態でのアメーバの行動を視覚化および定量化することです。

プロトコル

1. アカントアメーバ の準備

注:このプロトコルは、ATCC 50655、30872、50702、30010、30461、50370、50703、30137、PRA-115、およびPRA-411で検証されています。これはBSL2病原体であり、BSL2フードとラボ内で作業する必要があります。

1. T75フラスコに30 mLのAC6培地を充填し、1つのプラグまたはサンプルバイアルの内容物を無菌的に添加して、サンプルバイアルまたは調製したプラグ²⁰ からマスター培養物を作成します。フラスコが50%から80%コンフルエントになるまで、フラスコを26〜30°Cで3〜5日間インキュベートします。
2. 栄養型の均質な集団を作成するために必要になる前日に細胞を継代します。
   1. ひずみのニーズに応じて、付着した栄養型を取り除くために、マスターカルチャーを2x振ったり、活発に打ったりします。
   2. T75フラスコに30mLのAC6培地を入れます。マスターカルチャーを2mLを継代に加えます。フラスコを26〜30°Cで18〜24時間インキュベートします。
3. 収穫前に、顕微鏡で4倍の倍率で栄養型石の集団を目視検査します。栄養型が付着し、均一であることを確認してください。
4. フラスコを2回勢いよく叩いて、付着した栄養型を取り除きます。内容物を50mLのコニカルチューブに注ぎます。
5. バランス遠心分離機でチューブを500 x g で5分間回転させ、アメーバをペレット化します。上清培地を注ぐかピペットで取り除き、廃棄します。ペレットを2〜10mLの1/4リンガー液で希釈します。
6. サンプルをボルテックスします。10 μLのサンプルを使い捨て血球計算盤に加え、 アカンタメーバのCFU/mLをカウントします。
7. 血球計算盤のカウントに基づいて、アメーバペレットを1/4リンゲル溶液中で7.5 x 10³ 細胞/mLの濃度に希釈します。
8. 表面にアメーバを播種し、ガラス、プラスチック、または非栄養寒天、および以下に説明するように実験のニーズに応じてさまざまなウェル形状にすることができます。
   1. 96ウェルプレート:各ウェルに200μLの アカントアメーバ 懸濁液を播種し、プレートを蓋で囲みます。
   2. 48ウェルプレート:各ウェルに1 mLの アカントアメーバ 懸濁液を播種し、プレートを蓋で囲みます。
   3. フローセル:チャンバー内の気泡を避けながら、滅菌アルミニウムフローセルの滅菌ポートから4mLの アカントアメーバ 懸濁液をゆっくりと加えます。クランプ サスペンションを追加した後、ポートを閉じます。
9. イメージングの前に、顕微鏡記録を開始する前に、アメーバが表面に少なくとも30分間付着するのを待ちます。

2. アカントアメーバの可視化と記録

1. 明視野でアメーバを4倍の倍率で視覚化します。背景は明るい灰色に、アメーバは黒にする必要があります。アメーバが半透明ではなく、単色の暗い円になるように、光と焦点を調整します(したがって、焦点が少し合っていない、 図1)。
   注:最適な倍率は、いくつかの理由から追跡のために4倍です:追跡中に視野を出たり入ったりするアメーバはデータ分析に含めるべきではないため、低い倍率は、一定期間に分析に含まれるアメーバの最大数を最もよくサポートします。Amoebaは、トラッキング分析のためにバイナリに変換するために、明視野に黒い実線の円として表示される必要があります。これは、高倍率でアメーバの半透明の性質と内部構造が簡単に明らかになるため、低倍率で達成するのが最も簡単です。一般に、より多くのアメーバを1つの視野でより低い倍率で捉えることができ、より堅牢なデータ分析をサポートします。
2. イメージングソフトウェアの録画プログラムを設定して、アメーバを追跡するために定期的に画像を記録します。正確な追跡を可能にする画像間の最長時間は30秒で、ファイルサイズと追跡の詳細の最適な時間は12秒または24秒にすることをお勧めします。
3. アメーバは一度に数日間追跡できますが、この種の記録が生み出すファイルサイズと、非常に大きなファイルを操作することの本質的な難しさに注意してください。これを回避するには、特定の間隔で時間のセクションのアメーバを記録します。たとえば、12 時間ごとに 1 時間、5 日間記録します。
4. 顕微鏡とプログラムで許可されている場合は、プレートウェルのXY座標またはフローセルの複数の位置を使用して、1回のセッションで複数のウェルを記録します。必要に応じて、1つのウェルまたはフローセルの複数のセクションをつなぎ合わせて、4倍の倍率で視野を広げます。
   注:記録できる場所の数に関する唯一の制約は、画像間隔時間内に顕微鏡ステージが位置間を移動できる速度です(たとえば、12秒、24秒ごとに画像を撮影するなど)。ただし、これは必須ではなく、1 つの場所から作成されたビデオの追跡には、堅牢な統計分析に十分な数のトラックを含めることができます。本研究では、ニコンのEclipse製Ti-U顕微鏡を使用し、自動移動ステージを用いて複数のウェルの画像を一度に記録しました。ただし、プログラム可能な記録機能を備えた顕微鏡であれば、どれでも機能します。顕微鏡はコンピューターに接続し、プログラムまたはハードドライブに画像を記録できる必要があります。

3. アメーバサイズ解析

1. イメージングソフトウェアで顕微鏡ファイルを開きます。バイオフォーマットのインポートオプションが開きます。ダイアログボックス内で、次の点が当てはまることを確認します。 スタック表示。表示:選択-Hyperstack;メモリ管理: [仮想スタックを使用する] をオンにします。カラーモード: デフォルト。
2. 他のドロップダウンメニューやチェックボックスがアクティブになっていないことを確認します。 [OK] をクリックします。
3. バイオフォーマットシリーズのオプションを開きます。必要なシリーズを選択します。一度に 1 つの場所しか記録されない場合、ここには 1 つのオプションしかない可能性があります。 [OK] をクリックします。
4. 「イメージ」>「複製」を選択すると、一度に作業中の 1 つのウェルのみが複製され、1 つの C チャネルと 1 つの Z チャネルのみが選択されます。
5. ここからは、元の画像ではなく、複製された画像のみを操作と分析に使用します。 [Image (イメージ)] > [Type (タイプ)] > 8 ビットを選択します。 「プロセス」>「背景の減算」を選択します。
6. 転がるボールを 10.0 に設定します。 明るい背景を確認します。 スライディングパラボラチェック。
7. [プロセス] > [コントラストを強化] を選択します。飽和ピクセルを、栄養型の場合は .1%、セルと凝集体のグループの場合は 0.3% に設定します。
8. [ Image (イメージ)] > [Adjust > Threshold (しきい値の調整)] (デフォルトは B&W >) を選択します。バイナリ作成プロセスが開きます。 [Default] を選択し、[ Black background (of Binary Masks)] をオンにします。
9. しきい値を積極的に選択して、ほとんどの背景スポットが見えなくなり、各アメーバの一部が表示されるようにします。
10. イメージングソフトウェアが画像を反転し、背景が白で、アメーバが黒の場合は、[ 編集] > [反転 ] に移動して、背景が黒でアメーバが白になるように修正します。
11. 「Process> Binary > Close」を選択します。これは、細胞の焦点が合っていないか、細胞の運動性が悪いために、細胞が外膜にわずかなスペースを持っている場合に備えています。
12. 「Process > Binary > Fill Holes」を選択します。アメーバ以外のアーティファクトを削除するには、シェイプ描画ツールと [Edit > Fill] を使用します。この時点で背景が白で、アメーバが黒の場合は、[編集] > [反転] を選択します。この時点で、画像は図 2 のバイナリ画像を表す必要があります。
13. 各アメーバのサイズを記録するには、「 分析」>「粒子の分析」を選択します。セットサイズ:10-インフィニティ、真円度:0-1、表示:なし。 「結果のみ表示」と「集計」をオンにします。
14. 表示されたCSVファイルを保存します。「 ファイル」>「名前を付けて保存」> Tiff を選択し、名前を希望の仕様に編集します。

4. トラッキング用顕微鏡ファイルの作成(運動性解析)

1. イメージングソフトウェアで顕微鏡ファイルを開きます。バイオフォーマットのインポートオプションが開きます。
2. ダイアログボックス内で、次の点が当てはまることを確認します。 スタック表示。一緒に表示: Selection-Hyperstack.メモリ管理については、[ Virtual Stack を使用する] をオンにします。 [OK] をクリックします。
3. Bio-Formats Series Optionsが開きます。必要なシリーズを選択します。一度に 1 つの場所しか記録されない場合、ここには 1 つのオプションしかない可能性があります。 [OK] をクリックします。
4. 「Image > Duplicate」を選択します。ここからは、元のファイルで作業するのではなく、ビデオの複製されたセクションでのみ作業します。
   注: その時点で追跡されているビデオのセクションを複製します。これを行うには、実験に必要な分に対応するフレームを知る必要があります。たとえば、1^時間 目を追跡し、24 秒ごとに画像を撮影する場合、^{1 時間} 目には 150 フレームが必要です。したがって、^{1 時間} 目はフレーム 1 から 150 まで、2^時間 目は 151 から 300 までとなります。
5. [Image (イメージ)] > [Type (タイプ)] > 8 ビットを選択します。「処理」>「背景の減算」を選択します。ローリングボールを10.0に設定します。
6. 明るい背景を確認します。スライディングパラボラチェック。[処理] > [コントラストの強化] を選択し、0.1% に設定します。
7. [All x# Slices] をオンにします (たとえば、150 個のスライスすべて)。[正規化] のチェックを外します。[Image (イメージ)] > [Adjust > Threshold (しきい値の調整)] (デフォルトは B&W >) を選択します。
8. バイナリ作成プロセスが開きます。 [デフォルト] を選択します。(バイナリマスクの )黒い背景 を確認します。
9. 閾値を積極的に設定すると、ほとんどの背景スポットは見えませんが、アメーバの一部は見えます。このステップで、背景が白でアメーバが黒の場合は、[ 編集] > [反転] を選択します。背景は黒、アメーバは白にする必要があります。
10. [ Process (処理)] > [Binary > Close (閉じる)] を選択します。 [Process > Binary > Fill Holes] を選択します。「 ファイル」>「名前を付けて保存」> Tiff を選択し、名前を希望の仕様に編集します。これで、ファイルを追跡できる状態になりました。

5. トラッキングによる運動性の分析

1. トラッキングを開くために必要なtiffファイルを持つイメージングソフトウェアから、 Plugins > Tracking > Trackmateに移動します。Trackmate のバージョンが開きます。
2. [次へ] を選択します。ディテクタのドロップダウンメニューから [LoG] ディテクタを選択します。推定ブロブの直径を 35.0 ミクロン、しきい値 1.0 に設定します。[Use median filter] と [Do sub-pixel localization] のチェックを外します。
3. 最初、中間、および最後のスライスで 「プレビュー 」をクリックします。すべてのアメーバが紫色の円で捕らえられ、背景の欠陥やアーティファクトが含まれていないことを確認します。
4. [次へ] を選択します。処理が開始され、この手順の実行には数分かかる場合があります。画面上部の検出バーは、プロセスがどの程度完了したかを示します。
5. プロンプトが表示されたら [ 次へ ] を選択します。初期しきい値設定では、何も選択せずにもう一度 [次へ ] を選択します。ビューを選択するときは、[ Hyperstack Displayer ] を選択します。 [次へ] を選択します。
6. スポットにフィルターを設定し、何も選択せずに [次へ ]を選択します。トラッカーを選択します。これを行うには、(Simple LAP Tracker の代わりに ) LAP Tracker を選択します。 [次へ] を選択します。
7. フレーム間リンクでは、最大距離を 40 μm に設定します。トラック セグメントのギャップ閉鎖では 、[ギャップ閉鎖を許可]をオンにします。この距離の最大距離を 100 μm に、最大フレーム ギャップを 4 に設定します。[トラック セグメントの分割] または [トラック セグメントのマージ] は何も選択しないでください。
8. [次へ] を選択します。追跡の実行には、かなりの時間がかかる場合があります。完了すると、ウィンドウの下部に「追跡が完了しました」と表示されます。[次へ] を選択します。
9. 追跡が完了したら、もう一度 [次へ ] を選択します。トラックにフィルターを設定する: 左下の + 記号を選択して、トラック内のスポット数のフィルターを追加します。フレームの少なくとも93%でフィルターを[上]に設定します(たとえば、150フレームには最低140スポットが必要です)。
   注:このソフトウェアのバージョンによっては、少なくとも7%未満など、反対の同等のものを選択する必要があります。これは、線を左または右にドラッグして目的の数値に到達することで実行できます。
10. [次へ] を選択します。表示オプションが表示されます。各フレームのトラックが変形したり、アメーバの動き方が奇妙でなかったりしてから、Trackmate XMLファイルまたはTracks CSVファイルを保存してください。
11. トラックを削除する必要がある場合は、 TrackSchemeをクリックします。TrackSchemeは、すべてのフレームにわたるアメーバのすべてのトラックと接触点を表示します。
    注:トラックを削除する理由として考えられるのは、記録中にアメーバが視野内を歩き回った、トラックがアメーバの実際の経路と比較して不適切な形状になっている、または何らかの理由でトラックまたはアメーバが実験パラメータによるデータの外れ値であるなどです。
12. アメーバをクリックすると、画面上のスポットが緑色に強調表示され、Trackschemeではスポットの周囲に緑色の正方形が表示されます。これにより、削除する必要があるトラックまたはスポットが表示されます。
13. 削除する必要があるトラックを右クリックし、[ トラック全体]を選択します。 [削除 ]ボタンを押します。
14. すべてのトラックを確認したら、トラッキングソフトウェアのポップアップの左下にある[ 保存] をクリックして、トラッキングファイルを保存します。ビデオ名を使用して XML ファイルを保存します。[ 再開] をクリックして、追跡ソフトウェアのポップアップに戻ります。
15. 「トラック」をクリックし、左側の「トラック」を選択します。[CSV にエクスポート] をクリックし、CSV ファイルを保存します。
16. スプレッドシートが結果の CSV を認識しない場合は、次の手順を実行します。
    1. 保存したCSVファイルをメモ帳で開きます。 Control + A と Control + C をクリックして、すべてのコンテンツをコピーします。
    2. スプレッドシートを開き、[ Ctrl]+[V ]をクリックしてスプレッドシートに貼り付けます。すべてのデータが 1 つのセルに収まります。
    3. データが選択されたままのセルで、[ データ] > [テキスト] から [列] に移動します。[ 区切り] > [次へ] を選択します。[ Next > Finish] > [Comma] を選択します。このファイルを新しい CSV として保存します。
17. トラッキングCSVには、分析に使用できる多くのパラメータがあります(図3)。必要なパラメータをコピーして新しいCSVファイル(図4)に貼り付けて分析します。ここで使用するパラメータについては、以下で説明します。
    1. 総移動距離:アメーバが移動した総距離(μm)。
    2. 最大移動距離:アメーバの経路上の始点からの最大距離 - これは必ずしも終点であるとは限りません
       
       ここで、dij は、トラック上の任意のスポット i から任意のスポット j までの距離です。
    3. 閉じ込め率:閉じ込め率は、アメーバが開始点から離れて直線的に移動したか(1に近い値)、または開始点に比較的近いままでいたか(0に近い値)など、アメーバが開始点からどれだけ効率的に逃げたかを示します。
       
    4. トラック平均速度:アメーバの総移動距離に対する平均速度(ミクロン/秒)。
       
    5. トラック変位:アメーバの始点と終点の間の距離(ミクロン単位)。
       注:すべてのイメージングソフトウェア解析パラメータとその定義は、https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/ に記載されています。保存された各ファイルは、その時点で分析されたトラックの要約であることに注意してください。堅牢なデータ解析を行うには、データに適したように、複数の反復、時間などの結果を適切に組み合わせる必要があります(図5 および 図6)。

結果

この方法を使用して成功を収めるには、考慮すべきいくつかの重要な全体的な要素があります。1つ目はアメーバと顕微鏡の物理的なセットアップ、2つ目はイメージングソフトウェアの適切な利用、3つ目はイメージングデータのエクスポートと分析です。

顕微鏡による記録を開始する前に、アメーバが顕微鏡のステージに適切に焦点を合わせていることを確認することが重要です(図1)。ここでは、個々の詳細に最適なZ平面でアメーバに焦点を当てるのではなく、細部まで見ると半透明の状態とは対照的に、黒一色の点になるように、焦点を少しずらして見るのが理想的です。このように表示することで、イメージングソフトウェアとトラッキングソフトウェアは、ファイルをバイナリに変換するときに、個々のアメーバをより簡単に見つけることができます(図2)。イメージングソフトウェアで目標が何であるか、つまり、各アメーバが明確に定義された白い円として表示されることを知ることは、読者が明視野で元の画像を撮影するときに適切な焦点を見つけるのに役立つ可能性があります。次に、各円が明確に定義されると、追跡ソフトウェアは各アメーバの運動性を適切に追跡し、各アメーバの個々の運動性指標を収集できるようになります。

イメージングソフトウェアとトラッキングソフトウェアについて上記のプロトコルのステップバイステップの指示に従い、イメージングソフトウェアの使用の重要な最初のステップを支援するために関連するビデオを参照した後、定量化とデータ分析のためにイメージングソフトウェアデータをエクスポートします。トラッキング・ソフトウェアからの生の出力は、 図3に示すものと似ています。ここでは、エクスポートしたトラックのスポット数が期待値に対して正しいことを確認することが重要です(たとえば、すべてのトラックにフレームの93%が存在するように要求し、ビデオに合計100フレームがある場合、エクスポートされたすべてのトラックは93以上のスポットを持つ必要があります)。スポットが要件に一致しない場合は、追跡ソフトウェアの手順を遡って、必要なパラメータが正しく設定されていることを確認する必要がある場合があります。

未加工のエクスポートから、データ分析シートの作成を開始します(図4)。すべてのトラックは、単一の複製内の単一のアメーバを表していることを覚えておくことが重要です。したがって、 図 4、 図 5、および 図 6 に見られるように、フレームセットまたはタイム ポイントのすべてのトラックを平均化する必要があり (図 4)、このプロセスは、シリーズ全体のフレーム セットまたはタイム ポイントごとに実行する必要があります (つまり、合計 3 時間のビデオが取得され、データ ポイントが時間で分割される場合)。 その後、反復ごとに分析するフレームセット/時間が3つになります( 図5)。最後に、各レプリケートに設定された各フレームの平均のこの組み合わせから、各レプリケートの平均データを 1 つのスペースに結合して、複数のレプリケート間のデータを分析して、時点ごとの真の平均と標準偏差を決定できるようにする必要があります(図 6)。

各反復の平均はデータ分析に使用され、すべての反復の平均と標準偏差の組み合わせまたは標準誤差はグラフ表現に使用されます( 図7の例を参照)。ここで行ったように、複数のサンプルが複数の時点で追跡されているデータを分析する場合は、事後テューキー検定で2元配置反復測定ANOVAを使用してデータを分析するのが最も適切です。これにより、各時点でのサンプル間の違いを判断し、各サンプル内の経時的な違いも判断できます。

図1:アメーバは、明視野顕微鏡では不透明な暗い形態として現れます。 アメーバの代表的な画像を4倍の倍率で拡大し、わずかにピントが合っていないため、実線のくまとして現れます。スケールバー = 500 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:明視野顕微鏡で画像化されたアメーバをバイナリに変換して追跡。 アメーバを4倍倍に拡大し、明視野で(左)、アーチファクトを除去してバイナリに変換し(中央)、追跡後に選択したトラックを表示(右)しました。上段:4枚の画像をつなぎ合わせてウェル全体を撮影したもの、スケールバー=1000μm。下の行:ステッチ前の1つの画像のサイズ、スケールバー= 500 μm。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:イメージングおよびトラッキングソフトウェアからの即時データ解析出力には、さまざまなデータタイプが含まれています。 トラッキングからの代表的な出力を 図 2 に示します。図 2 は、1 本のビデオです。トラック番号(赤い矢印)のスキップ番号は、トラッキングソフトウェアがパラメータと一致しないトラックを正しく削除したことを示しています。この例では、5385 本中 71 本のみがパラメーターに一致したトラックを特定しました。このような厳格なガイドラインを考えると、この比率は正常です。このトラック数は、このプロトコルで使用されるアメーバの数とも一致しています(例えば、96ウェルプレートにウェルあたり7.5 x 10^CFU /mLの200 μLを播種すると、ウェル内には約1,500個のアメーバが存在し、4ステッチの視野でほぼ同じ数が見えると予想されます。アメーバが視界を出たり入ったりするため、アメーバよりも多くのトラックが存在する可能性があります。このトラック番号は、 図 2 でも明らかであり、多数のスポットに対して少数のトラックしか見えません。トラック内のスポットの数(赤いボックス)を常に確認して、正しいトラックの長さのみが含まれていることを確認してください。たとえば、ここではフレームの 93% 以上が含まれており、このセクションには 127 フレームが含まれているため、すべてのスポット数が 118 を超える必要があります。黄色で強調表示されているのは、プロトコルに記載されている測定値です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:初期データ出力に続いて必要に応じて再編成されたデータ。 エクスポート後の必要なデータの整理。(A)定量化するために選択された適切な測定値は、追跡ソフトウェアのエクスポート(図3)からコピーされ、新しいスプレッドシートに貼り付けられました。(B)目的の測定値が新しいスプレッドシートに整理された後、各トラックの平均を計算する必要があります。したがって、この代表的な例では、この特異なビデオで使用可能なすべてのトラックの合計距離、最大距離、閉じ込め、平均速度、および変位は、各測定値の特異な数値に平均化されています。ここでも、合計 71 トラックがフレーム 1 から 127 のパラメーターを満たしていることに注意してください。 図 5 に示すように、分析される各ビデオまたはフレーム セットから適切なトラックの数が異なる可能性があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:画像シリーズまたはビデオ全体の分析用に設定されたシーケンシャルフレーム。 データ分析にシーケンシャル動画を追加している代表的なイメージです。フレーム 1 から 127 がビデオの 1 時間目を構成すると仮定します (ここでは、1 時間は 28 秒ごとに画像を撮影することで構成されています)。フレーム 128 から 254 はビデオの 2 時間目、フレーム 255 から 381 はビデオの 3 時間目になります。すべての時間からエクスポートされたデータ ( 図 3 でエクスポートされたデータ) を 1 つのシートに結合して、一度にすべてを操作します。 図4で行ったように、各フレームセット/hのすべての使用可能なトラックからのデータが平均化されます。 図5 のすべては、1つのレプリケートまたは1つのサンプルからのデータです。反復が 3 つある場合は、同じようにレイアウトされた 3 つの個別のスプレッドシート タブがあり、これらのデータは新しいタブに供給されます ( 図 6 参照)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:各フレームセット内のすべてのアメーバからの合成データで、1回の複製を表すために使用。 (A) 図5 で設定した各フレームの平均をすべて中央に集めて、最終的なデータ解析を完了する必要があります。この代表的な画像では、最初の 3 つのフレーム セット (または時間) の合計距離の平均が表示されています。これは、実行するサンプル/条件/レプリケートごとに繰り返す必要があります。次に、各フレーム セットの各サンプルからの平均を平均化する必要があります (黄色のボックス)。これは、標準偏差と標準誤差を計算できる最終的なデータポイントです。各サンプルの個々の平均 (ここでは、合計距離サンプル 1 の B3、B4、B5 の数値。C3、C4、C5 (Total Distance Sample 2 など)統計分析を実行するために使用されます。このプロセスは、必要なすべての測定(最大距離、閉じ込め、平均速度、変位など)に対して繰り返されます(B)定量化をグラフで表現するには、黄色のボックス内の数値をデータポイントとして使用し、最終的なグラフに使用します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:ATCC 30461およびATCC 50370の生の運動性データ。生データ(ここでは1時間あたりの平均±SEとして表される)は以前に収集されており、以前の研究^18,19については発表されていません。この運動性の定量化は、これら2つのアメーバが、ガラス表面上の1/4リンガー溶液中の運動性の最初の6時間(その時間に移動したミクロン単位の合計距離で測定)で類似していることを示しています。各時点は 3 つの別々の反復を表し、それぞれが 20 から 200 のアメーバ トラックで構成されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

アカンタメーバのようなアメーバの運動性を追跡し定量化できることは、低速のブラウン運動の影響を受けない付着微生物^{である9,10}、アメーバの行動に関するかなりの量の情報を明らかにし、AK予防方法に関する啓発を大幅に高めることができる。このプロトコルは、最近の出版物で詳述されており、データは他の同様のデータ分析^18,19によって確認されているか、または組み合わされている。ここで、この方法を使用して詳述されたアメーバの速度は、他のグループによって発表されたものと類似していることに注意します。このプロトコルは、光に対して透明な基本的にあらゆる表面またはアメーバ処理に使用できる能力で注目に値しますが、このプロトコルは他の生物と機能するように変更される可能性がありますが、これまでのところアカンタメーバ用に最適化されているだけであることに注意することが重要です。上記のプロトコルはラボで一貫してうまく機能していますが、他のニーズに合わせてメソッドを変更したり、困難な状況をトラブルシューティングしたりするために、次の変更が加えられています。

トラッキングパラメータの決定:上記のプロトコルでは、フレーム間リンク、ギャップクローズ、最大フレームギャップ、およびトラック上のスポット数がリストされており、これらは最近の出版物に最も適していました。ただし、他のパラメーターが他のニーズにより適している可能性があります。さらに、他のユーザーが使用したいのにここでは使用されていないパラメーター (トラック フィルターの下のトラックの最大距離など) がある場合があります。各パラメータの詳細とそれらが説明している内容については、こちらのWebサイト(参照²¹を参照)でアクセスできます。どのパラメータとフィルターが他の実験に最も関連し、どのように設定すべきかを決定する際には、特定のプロジェクトにとって統計的に何が合理的であるかを考えてください。たとえば、アメーバが歩き去り、その後視野に戻るデータが必要になるでしょうか?それとも、まったく動かなかったにもかかわらず、トラックとしてタグ付けされたアメーバのデータを保持したいのでしょうか?また、画像が記録されたときのフレーム数とフレーム間の時間の長さに意味があるものは何ですか。

ブロブサイズの変更:現在の技術や標準的なラボで利用可能なソフトウェアに基づくソフトウェアや顕微鏡のセットアップでは、時間の経過とともに変化するアメーバの数を骨材内で正確に追跡することは非常に難しいことがわかりました。ブロブのサイズを追跡し、そのサイズをその中の生物の数と関連付けようとする場合は、実験を繰り返した後に生成された標準曲線を使用して、集合体のサイズを数学的に予測します。たとえば、凝集体は、ウェルあたり8、16、32、125、250、500、1,000、2,000セルなど、さまざまな数のアメーバをウェルに播種することによって作成されました。各ウェルのさまざまな時点における24時間のタイムラプス画像を生成しました。各スフェロイド(既知の数のアメーバ)を2次元領域について分析し、アメーバ数とスフェロイドサイズの経時変化の関数として標準曲線を生成しました。この実験は、生成された曲線の適切な標準偏差を得るために、少なくとも3回で繰り返されました。

アメーバの方向性の決定:これは特定の研究には必要ではないかもしれませんが、アメーバの方向性を理解することは役立つ場合があります。これにより、治療または実験の走化性効果に関するデータが得られます。このデータは、ビジュアル (グラフィック) データと定量的データの両方を作成するためにも使用できます。これは、イメージングソフトウェア用の無料プラグインであるChemotaxis and Migration Toolから利用できます。応募ガイド、サンプル画像・動画( 資料表参照)とともに、ウェブサイト上で公開しています。

詳細な移動ダイナミクス:他のグループは^{、ここで議論}されているものを超えて、高度に高度で開発された統計分析を使用して、拡散ダイナミクスと拡散軌道を調査しました^9,10,22。これらは、ユーザーのニーズに基づいて検討できます。

成功した方法と同様に、この原稿で詳述されているプロトコルは、一貫性を達成するために何度もトラブルシューティングを経てきました。優れた高品質の追跡可能なビデオは、毎秒(または顕微鏡で可能な限り速く、1秒未満)の画像を撮影することで作成できますが、これにより非常に大きなファイルが作成され、作業が難しくなる可能性があります。これは、最大で数分間録画された非常に短時間のビデオにのみ現実的に適しています。逆に、数秒ごとに画像を撮影することで、アメーバの行動はこの種の速度に基づいてまだ非常に追跡可能であり、数時間または数日にわたって実行可能なビデオを作成できることがわかりました。画像間の最大時間は30秒であり、これはアメーバがイメージングソフトウェアによって正確に追跡されるために必要な時間であることがわかりました。ユーザーが選択する時間間隔は、顕微鏡が画像を記録できる速度、ウェルごとに必要な画像の数、および各間隔で記録されるウェルの数という既知の制約を使用して検討する必要があります。同様に、このプロトコルで言及されている最大変位、許容フレームギャップ、必要な最小フレームなどに関するパラメータは、このラボが試行錯誤を通じて決定し、最も完全なアメーバトラックを含むトラック情報を作成し、不完全なトラックによって生成されるノイズ、ビデオの途中でステージに参加または離れるアメーバ、または2つのアメーバがトラックの途中で出会ってから分離するなどのイメージングソフトウェアの混乱によって生成されるエラーを無視します。このようなエラーや不完全なトラックは、常に相互に相互作用している微細な生物の非常に長い(数時間から数日)ビデオを作成するときには当然のことながら高く、そのためにエラーのあるトラックの大部分を拒否する必要があります。このラボの経験では、プロトコルの穴埋めステップは、イメージングソフトウェアがアメーバを追跡する方法のエラーを減らすために重要であることに注意すべきです。各アメーバがドーナツやC字型ではなく、実線の円であることを確認することで、ソフトウェアは各アメーバを成功裏に追跡できる可能性がはるかに高くなります。

さらに、説明したように、ユーザーが画像またはビデオを分析するために利用できる多くのパラメーターがあります。実験的なニーズに基づいて、総距離、最大距離、速度、および変位の分析から一貫して最も恩恵を受けています。これらについては、以前の出版物^18,19でグラフィカルな解釈とともに詳細に説明されています(異なるひずみと表面の使用を含む)。これらの4つのパラメータにより、ユーザーはアメーバが直線距離を移動する能力とそれにかかる時間を推定することができ、コンタクトレンズの汚染に関連するアメーバの行動を理解するのに役立ちます。これらのパラメータを取得して分析することは、図で詳しく説明されているように、大きな作業です。イメージングソフトウェアの出力から大規模で多数のスプレッドシートを扱いながら、必要なすべての分析を自動計算するロックされたスプレッドシートテンプレートを作成することで、意図しないエラーを制限しました。ただし、この方法の改善点として考えられるのは、このデータを処理し、並べ替えて分析できるスクリプトを作成することです。

結論として、ここでは、さまざまな条件で アカントアメーバ のサイズと運動性を測定するためのアクセス可能で正確な方法について説明します。私たちは、この方法が多くの異なるアメーバ株に適用できることを実証し、運動性情報を得るための単純なパラメータがあるかもしれない一方で、この実験セットアップは任意の特定のニーズに合わせて高度に調整できることを概説しました。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ Ringer’s solution	ThermoFisher Scientific	BR0052G	Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers.
10 µL pipette	Eppendorf Research	3123000039	2 µL-20 µL single channel
10 µL pipette tips	Neptune Scientific, San Diego, CA, USA	BT10.N	10 µL Universal Barrier Tip
48 well plate	Millipore Sigma,	CLS3548	Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid
50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample)	Fisher Scientific	Falcon 352098	Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene
96-well plate	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	CLS3596	Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid
Acanthamoeba	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	ATCC 30461	This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411
Axenic culture media (AC6)	Made in house	n/a	Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months.
Centrifuge and appropriate rotor	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Sorvall ST 40R	Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min
Chemotaxis and Migration Tool			Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html
Disposable hemocytometer	Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA	DHC-N01	Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic
ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.)			Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/
Microscope, preferably with automated moveable stage	Nikon, Tokyo, Japan		A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time.
NIS-Elements software	Nikon
Serological pipette	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	BrandTech 26331	BrandTech accu-jet pro Pipet Controller
Serological pipette tips	VWR	5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088	VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic
Sterile aluminum transmission flow cell	Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA	FC 81-AL	Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope
T75 Flasks	VWR, Radnor, PA, USA	734-2316	VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile