卵子特異的な全身および粘膜応答を促進するためのアジュバントとしてのカチオン性ナノエマルジョン内包レチノイン酸

要約

このプロトコルでは、抗原特異的な全身性および粘膜応答を促進するためのアジュバントとして使用されるカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸(RA)を開発しました。FDA承認のRAをナノエマルジョンに添加することにより、ナノエマルジョンの筋肉内注射後、抗原特異的sIgAが膣および小腸で促進された。

要約

カチオン性ナノ構造は、樹状細胞の成熟、ROS生成、および抗原取り込みを促進し、抗原特異的免疫応答を促進するアジュバントおよび抗原送達システムとして浮上しています。近年、レチノイン酸(RA)は粘膜免疫応答を活性化する効果があるため、ますます注目されています。しかし、RAを粘膜アジュバントとして使用するためには、その溶解、負荷、および送達の問題を解決する必要があります。ここでは、カチオン性脂質1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOTAP)、レチノイン酸、油相としてのスクアレン、界面活性剤としてのポリソルベート80、および共界面活性剤としてのトリオレイン酸ソルビタン85で構成されるカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸(CNE-RA)送達システムについて説明します。その物理的および化学的特性は、動的光散乱と分光光度計を使用して特徴付けられました。抗原(オボアルブミン、OVA)とCNE-RAの混合物によるマウスの免疫は、OVA単独と比較して、マウスの膣洗浄液および小腸洗浄液中の抗OVA分泌性免疫グロブリンA(sIgA)のレベルを有意に上昇させた。このプロトコルは、CNE-RAのアジュバント効果の調製、特性評価、および評価のための詳細な方法を記述しています。

概要

アジュバントは、免疫系を刺激してワクチンに対してより強く反応させることにより、ワクチンの有効性を高めるためによく使用され、それによって特定の病原体に対する免疫力を高めます¹。ナノエマルジョン(NE)アジュバントとは、油相と水相の一定の割合を乳化して油中水型(W / O)または水中油型(O / ^W)の形態のエマルジョンを生成することにより、熱力学的安定性を備えたコロイド分散システムを指します2。O / Wナノエマルジョンアジュバントは、注射部位でサイトカインとケモカインを生成し、単球、好中球、好酸球などの重要な免疫細胞の急速な凝集と増殖を誘導し、免疫応答を増強し、抗原の免疫原性を改善する^{ことができます3}。現在、3種類のナノエマルジョンアジュバント(MF59、AS03、AF03)がワクチンへの使用許可を受けており、良好な安全性と有効性が示されています⁴。

しかし、粘膜免疫は、従来の非経口ワクチン接種で現在認可されているアジュバント製剤では十分に対処されていません⁵。レチノイン酸(RA)は、免疫細胞の腸内ホーミングを誘導することが報告されていますが、極性が低く、水への溶解性が低く、光と熱の安定性が低いため、強力な腸内ワクチン接種での使用が制限され....

プロトコル

動物実験は、実験動物の使用と世話に関するガイドに従って行われ、第三軍事医科大学の実験動物福祉および倫理委員会によって承認されました。

1. ナノエマルジョン(NE)の調製

1. 水相調製では、0.15 gのポリソルベート80を28.2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、40°Cで撹拌します。
2. 油相調製には、 表1に示すナノエマルジョンの油相製剤を使用する。ソルニタントリレア酸85、DOTAPおよびRAをスクアレンに溶解し、40°Cで撹拌する。
3. 一次O/Wエマルジョン調製では、1mL/minの速度で水溶液をゆっくりと滴下しながら、油相を1400rpmで磁気的に攪拌します。高剪断乳化剤を使用して、30,000rpmで6分間混合物を予備乳化します。
4. 高圧均質化(HPH)の場合、上記で調製した一次O / Wエマルジョンを高圧ホモジナイザーで900バールで12サイクル処理して、160〜190nmの範囲の均質なナノエマルジョンを得る。
5. プロセスの最後に、エマルジョンを50mLフラスコに回収し、0.2μmのPESフィルターメンブレンを通してエマルジョンをフィルター滅菌します。
6. カテーテルを介してフラスコをシュレンクラインに接続し、三方活栓を回転させてシステムを真空管に接続し、真空ポンプをオンにしてフ....

ディスカッション

このプロトコルでは、抗原特異的な全身性および粘膜応答を促進するためのアジュバントとして使用されるカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸を開発しました。従来のNEアジュバントと比較して、以下の2つの利点があります。まず、一般に、O/W NEの表面は負電荷が高いため、抗原を直接ロードすることは困難です。カチオン性NEは、ペプチドまたはタンパク質抗原を効果的?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1640 medium	GIBCO, USA	C11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab171529-1000 mL
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BSA	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Danamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano S90
DOTAP	CordenPharma, Switzerland	O02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)	mabtech	ab205719
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)	Abcam	ab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)	Abcam	ab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)	Abcam	Ab205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)	Abcam	ab97245-1mg
High pressure homogenizer	ATS
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
OVA323-339	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Phosphate buffer saline	ZSGB-bio	ZLI-9061
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
retinoic acid	TCI, Japan	TCI-R0064-5G
Squalene	Sigma, USA	S3626
T10 basic Ultra-Turrax	IKA, Germany
TMB ELISA Substrate	Abcam	ab171523-1000ml
trypsin inhibitor	Diamond	A003570-0100
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometer	Hitachi	U-3900