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この記事について

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  • 要約
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  • 参考文献
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要約

このプロトコルでは、抗原特異的な全身性および粘膜応答を促進するためのアジュバントとして使用されるカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸(RA)を開発しました。FDA承認のRAをナノエマルジョンに添加することにより、ナノエマルジョンの筋肉内注射後、抗原特異的sIgAが膣および小腸で促進された。

要約

カチオン性ナノ構造は、樹状細胞の成熟、ROS生成、および抗原取り込みを促進し、抗原特異的免疫応答を促進するアジュバントおよび抗原送達システムとして浮上しています。近年、レチノイン酸(RA)は粘膜免疫応答を活性化する効果があるため、ますます注目されています。しかし、RAを粘膜アジュバントとして使用するためには、その溶解、負荷、および送達の問題を解決する必要があります。ここでは、カチオン性脂質1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOTAP)、レチノイン酸、油相としてのスクアレン、界面活性剤としてのポリソルベート80、および共界面活性剤としてのトリオレイン酸ソルビタン85で構成されるカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸(CNE-RA)送達システムについて説明します。その物理的および化学的特性は、動的光散乱と分光光度計を使用して特徴付けられました。抗原(オボアルブミン、OVA)とCNE-RAの混合物によるマウスの免疫は、OVA単独と比較して、マウスの膣洗浄液および小腸洗浄液中の抗OVA分泌性免疫グロブリンA(sIgA)のレベルを有意に上昇させた。このプロトコルは、CNE-RAのアジュバント効果の調製、特性評価、および評価のための詳細な方法を記述しています。

概要

アジュバントは、免疫系を刺激してワクチンに対してより強く反応させることにより、ワクチンの有効性を高めるためによく使用され、それによって特定の病原体に対する免疫力を高めます1。ナノエマルジョン(NE)アジュバントとは、油相と水相の一定の割合を乳化して油中水型(W / O)または水中油型(O / W)の形態のエマルジョンを生成することにより、熱力学的安定性を備えたコロイド分散システムを指します2。O / Wナノエマルジョンアジュバントは、注射部位でサイトカインとケモカインを生成し、単球、好中球、好酸球などの重要な免疫細胞の急速な凝集と増殖を誘導し、免疫応答を増強し、抗原の免疫原性を改善することができます3。現在、3種類のナノエマルジョンアジュバント(MF59、AS03、AF03)がワクチンへの使用許可を受けており、良好な安全性と有効性が示されています4。

しかし、粘膜免疫は、従来の非経口ワクチン接種で現在認可されているアジュバント製剤では十分に対処されていません5。レチノイン酸(RA)は、免疫細胞の腸内ホーミングを誘導することが報告されていますが、極性が低く、水への溶解性が低く、光と熱の安定性が低いため、強力な腸内ワクチン接種での使用が制限されています。ナノエマルジョンは、親油性の高い薬物のバイオアベイラビリティを高める機会を提供し、O / Wエマルジョンアジュバントのオイルコアは、RA6などの非極性物質の溶解に適しています。したがって、ナノエマルジョンは、全身免疫および粘膜免疫の二重応答効果を達成するために、RAの担体として使用することができる。

中性または陰イオン送達システムと比較して、カチオン送達システムは比較的効率的な抗原カプセル化および送達能力を有し、抗原の免疫原性を高めることができる7,8,9。種々のアジュバント系のカチオン性表面電荷は、それらのアジュバント効果10,11,12にとって重要である。カチオン電荷は、注射部位でのワクチンの保持を延長し、抗原提示を増加させ、体内の細胞性免疫の刺激を延長する重要な要素です12。

以上の考察に基づき、RAと抗原を効果的に共送達するカチオン性ナノエマルジョンを開発した。ナノエマルジョンの粒子サイズおよびゼータ電位は動的光散乱(DLS)を用いて決定され、OVAと組み合わせたナノエマルジョンの全身および粘膜免疫応答を筋肉内注射によって評価した13。

プロトコル

動物実験は、実験動物の使用と世話に関するガイドに従って行われ、第三軍事医科大学の実験動物福祉および倫理委員会によって承認されました。

1. ナノエマルジョン(NE)の調製

  1. 水相調製では、0.15 gのポリソルベート80を28.2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、40°Cで撹拌します。
  2. 油相調製には、 表1に示すナノエマルジョンの油相製剤を使用する。ソルニタントリレア酸85、DOTAPおよびRAをスクアレンに溶解し、40°Cで撹拌する。
  3. 一次O/Wエマルジョン調製では、1mL/minの速度で水溶液をゆっくりと滴下しながら、油相を1400rpmで磁気的に攪拌します。高剪断乳化剤を使用して、30,000rpmで6分間混合物を予備乳化します。
  4. 高圧均質化(HPH)の場合、上記で調製した一次O / Wエマルジョンを高圧ホモジナイザーで900バールで12サイクル処理して、160〜190nmの範囲の均質なナノエマルジョンを得る。
  5. プロセスの最後に、エマルジョンを50mLフラスコに回収し、0.2μmのPESフィルターメンブレンを通してエマルジョンをフィルター滅菌します。
  6. カテーテルを介してフラスコをシュレンクラインに接続し、三方活栓を回転させてシステムを真空管に接続し、真空ポンプをオンにしてフラスコ内に真空を作り出します。次に、三方活栓を回転させて、システムをアルゴン管に接続し、アルゴンを充填します。この手順を3回繰り返して、フラスコにアルゴンが充填されていることを確認します。
  7. コルクとシールをパラフィンフィルムに交換し、フラスコをスズ箔で包み、4°Cで保管します。

2. ナノエマルションの特性評価

  1. 粒子径とゼータ電位の検出
    1. 装置の電源を入れ、レーザー光源が安定するまで30分待ちます。
    2. NEを超純水で50倍に希釈し、対応するサンプルセルに1mLのサンプルを加えます。
    3. 粒子径を測定するには、温度を25°Cに設定し、分散媒体として水を選択し、測定セルとして使い捨てプラスチック皿を選択します。サンプルをロードし、自動的に測定します。最終結果として、各サンプルの3つの繰り返し測定の平均値を報告します。
    4. ゼータ電位を測定するには、温度を25°Cに設定します。 分散媒体として水相を選択するため、Smoluchowsiモデルを選択し、測定セルとして折り畳まれた毛細血管セルを選択します。サンプルをロードし、自動的に測定します。最終結果として、各サンプルの3回の反復測定値の平均を報告します。
  2. カプセル化速度と薬物負荷率の決定
    1. NEにロードされたRAの量を決定するには、無水エタノールを使用してRAを解乳化し、NEから抽出します。5 μLのサンプルに995 μLのエタノールを加え、355 nmの分光光度計を使用して溶液のRA含有量を測定します。吸光度を標準曲線と比較します。次の式を使用します。
      カプセル化=実際のRA負荷/添加された薬剤の重量
      薬物負荷量=実際のRA負荷量/サンプルの品質

3.予防接種手順とサンプル収集

  1. 予防接種手順とグループ化
    1. 次の実験グループに従って、0日目、14日目、28日目に免疫するために、6〜8週齢で体重約18〜21gの雌Balb / Cマウスを5匹のセットで投与しました:(1)PBSグループ、(2)オボアルブミン(OVA)グループ、(3)OVA + NE-RA(OVA / NE-RA)グループ、(4)OVA + CNE-RA(OVA / CNE-RA)グループ。
    2. 投与前に混合した、100μLのエマルジョンと100μLのPBSに吸収された15μgのOVAの異なるワクチン製剤を200μLで、大腿四頭筋上部に筋肉内注射してすべてのマウスに免疫します。100μL/後肢を注入します。対照群のマウスには、PBSを単独で投与します。
    3. 安楽死:3回の予防接種の完了から2週間後に、1%ペントバルビタールナトリウム100mg / kgの腹腔内注射により、すべてのマウスを安楽死させます。
    4. サンプルの収集と処理:安楽死後、はさみを使用してマウスの胸を切り開き、注射器を心臓に直接挿入して約0.5mLの全血を吸引します。血液を室温で2時間放置した後、1800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 血清を採取し、アリコートを採取し、さらなる分析のために-80°Cで保存します。
    5. 全血、脾臓、膣洗浄液(VLF)、気管支肺胞洗浄液(BALF)、鼻洗浄液(NLF)、小腸洗浄液(SILF)を採取します。
  2. 脾臓リンパ球の単離
    1. マウスをエタノール75%(v / v)に浸して短時間滅菌し、マウスをクリーンベンチに移します。左腹部の皮膚をハサミで切り、脾臓を露出させて取り除きます。
    2. 3 mLのPBSが入ったシャーレに脾臓を入れ、ふるい(200メッシュ、70 μm)と粉砕ロッドを使用して15 mLの遠心分離チューブに粉砕してろ過します。
    3. 細胞を650 x g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、沈殿物を3mLの赤血球溶解液で懸濁し、室温で5分間インキュベートします。
    4. 10 mLのPBSをチューブに加え、よく振って反応を終了し、650 x g で室温で5分間遠心分離します。
    5. 上清を捨て、細胞を10mLのPBSに再懸濁し、細胞希釈液20μLを自動セルカウンターに添加して細胞計数を行います。
    6. 細胞を650 x g で室温で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を1640完全培地(1%ペニシリン-ストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清)で1 x 106 細胞/ mLに希釈します。
  3. VLF採取:1%BSA / PBSTの75μLで膣を4回すすぎ、洗浄液を混ぜ合わせて1.5mLの遠心チューブに回収し、5000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、ピペットで上清を回収し、-80°Cで保存します。
  4. BALFおよびNLFコレクション
    1. 犠牲後のマウスを75%(v / v)エタノールで消毒します。マウスの腹を上に持ち、首をまっすぐにします。はさみを使用してマウスの首の皮膚を縦方向に切開し、鉗子を使用して筋肉を分離し、気管を適切に露出させます。
    2. 小さな横方向の開口部から気管を切断し、ホースを肺に向けて挿入し、シリンジをホースに取り付け、0.5 mLのPBSを肺に注入して抜いた後、3回すすぎを繰り返し、650 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清(BALF)を-80°Cで保存します。
    3. ホースを鼻腔に逆さまにし、シリンジをホースに取り付けて0.5mLのPBSを注入すると、液体が鼻腔を通って1.5mLの遠心分離管に流れ込みます。遠心分離チューブから洗浄液を吸引し、すすぎを2回繰り返し、次いで650 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清(NLF)を-80°Cで保存する。
  5. SILFコレクション
    1. 小腸洗浄液として、0.1 mg/mLトリプシン阻害剤、50 mM/L EDTA-2Na、1 mM/Lフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を含むPBS溶液を調製します。室温で撹拌して溶解し、4°Cで保存します。
    2. 腸管に沿って小腸を切り開き、3mLの小腸洗浄液に浸します。15rpmで垂直振とうし、4°Cで30分間混合します。 1440 x g 、4°Cで20分間遠心分離し、ピペットで上清を回収し、次いで5000 x g 、4°Cで20分間遠心分離する。上清(SILF)を-80°Cで保存します。

4. OVA特異的抗体の筋肉内投与後の反応評価

  1. IgGの血清レベル、IgG1、IgG2aのサブクラス、およびVLF、BALF、NLF、SILFの特異的sIgAのレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により決定します。
  2. 抗原コーティングの場合は、OVAをコーティングバッファーで5 μg/mLに希釈し、96ウェルELISAプレートを1ウェルあたり100 μLのOVA溶液で4°Cで一晩コーティングします。
  3. ELISAプレートをPBSTで5回洗浄し、1%BSA/PBSTの250 μLで37°Cで2時間インキュベートしてブロックします。
  4. ELISAプレートをPBSTで5回洗浄し、以下に希釈したサンプル100 μLを加えて試験し、37°Cで1時間インキュベートします。0.5% BSA/PBST で希釈された血清、VLF、BALF、NLF を 20% ウシ胎児血清 (FCS)/PBST で希釈した SILF。
    1. 20 μL の血清を 1 mL に希釈し、次にこの希釈した血清 25 μL を 500 μL に希釈します。
  5. 1000倍で希釈した血清200 μLをコーティングプレートの1列目に加え、0.5% BSA/PBSTの100 μLを1列目を除くすべてのウェルに加えます。1列目から2列目に100μLを移し、ピペットで10倍混合します。このステップを行8まで繰り返し、100μLの液体を廃棄すると、IgGの検出のために異なる濃度の血清が得られました。
  6. BALF、NLF、および SILF を 1:1 希釈して IgA を検出します。VLFには、血清と同じ希釈手順を使用してください。
  7. ELISAプレートをPBSTで5回洗浄します。HRP標識ヤギ抗マウスIgG/IgG1/IgG2a/IgA(PBSTで1:10000に希釈)100 μLを適切なウェルに添加し、37°Cで40分間インキュベートします。
  8. ELISAプレートをPBSTで5回洗浄し、TMB ELISA基質(高感度)100 μLを加え、プレートを光から保護された場所に5分間移します。TMB基質用の450 nm停止溶液100 μLを直ちに添加して反応を停止します。
  9. 各ウェルの450nmの吸光度(OD)を測定し、ブランク群マウスの血清値の2.1倍を陽性応答値として抗体価を計算します。

5. ELISpotアッセイ

  1. ELISpot Plusのガイドラインに従い、キットのマウスIFN-γ(ALP)を使用してアッセイを行います。
  2. 密封されたパッケージからプレートを取り出し、滅菌PBS(200μL /ウェル)で4回洗浄します。プレートを1640完全培地(200 μL/ウェル)でコンディショニングし、室温で30分間インキュベートします。
  3. 培地を取り出し、ステップ3.2.2で調製した調整濃度のリンパ球懸濁液(100μL/ウェル)をプレートに加え、次いで刺激100μL、すなわち20μg/mLのOVA257~264またはOVA323~339または1640の完全培地を含む1640の完全培地を加える。プレートを37°Cの加湿インキュベーターに5%CO2 で48時間置きます。蒸発を防ぐために、プレートをアルミホイルで包みます。
  4. 細胞懸濁液を廃棄し、プレートをPBS(200 μL/ウェル)で5回洗浄します。検出抗体(R4-6A2-ビオチン)を、0.5%ウシ胎児血清(PBS-0.5%FCS)を含むPBSで1 μg/mLに希釈します。100 μL/ウェルを加え、室温で2時間インキュベートします。
  5. 手順5.2のようにプレートを洗浄します。ストレプトアビジン-ALP(1:1000)をPBS-0.5%FCSで希釈し、100 μL/ウェルを加え、室温で1時間インキュベートします。
  6. 手順5.2のようにプレートを洗浄します。すぐに使用できる基質溶液(BCIP/NBT-plus)を0.45 μmフィルターでろ過し、100 μL/ウェルを添加します。明確な斑点が現れるまで発達します。
  7. 水道水で広範囲に洗って発色を止め、軟質プラスチックを取り除き、プレートを乾かします。
  8. ELISpot リーダーでスポットを検査してカウントします。

6. 統計解析

  1. 4つのグループのデータ間の差を、一元配置分散分析とそれに続くテューキー多重比較の事後検定で分析します。すべての結果を平均として表し±0.05未満のP値は有意であると見なされました。

結果

合計で、4つのナノエマルジョン製剤を調製し、それらの粒子サイズ(図1)、それらのゼータ電位およびそれらのカプセル化効率によって特徴付けられる。粒子径は160〜190nm付近に集中し、DOTAPの添加によりナノエマルジョンのゼータ電位が逆転した。OVA特異的血清IgGおよび血清中のそのサブグループ抗体レベルは、3回目の免疫の2週間後に検出されました。ナ?...

ディスカッション

このプロトコルでは、抗原特異的な全身性および粘膜応答を促進するためのアジュバントとして使用されるカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸を開発しました。従来のNEアジュバントと比較して、以下の2つの利点があります。まず、一般に、O/W NEの表面は負電荷が高いため、抗原を直接ロードすることは困難です。カチオン性NEは、ペプチドまたはタンパク質抗原を効果的?...

開示事項

著者は、この作品に利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、重慶自然科学基金会の重点プログラム(第2020jcyj-zdxmX0027号)および中国国家自然科学基金会プロジェクト(第32270988号)の助成を受けて行われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1640 mediumGIBCO, USAC11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB SubstrateAbcamab171529-1000 mL
Automated Cell CounterCountstar, ChinaIC1000
BSASigma-Aldrich, USAB2064-100G
Centrifuge 5810 REppendorf, Germany5811000398
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
DOTAPCordenPharma, SwitzerlandO02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)mabtechab205719
Fetal Bovine SerumGIBCO, USA10099141C
Full-function Microplate ReaderThermo Fisher Scientific, USAVL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)Abcamab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)Abcamab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)AbcamAb205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)Abcamab97245-1mg
High pressure homogenizerATS
MONTANE 85 PPISEPPIC, FranceL12910
MONTANOX 80 PPISEPPIC, France36372K
OVA257–264Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.NA
OVA323-339Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.NA
Phosphate buffer salineZSGB-bioZLI-9061
Red Blood Cell Lysis BufferSolarbio, ChinaR1010
retinoic acidTCI, JapanTCI-R0064-5G
SqualeneSigma, USAS3626
T10 basic Ultra-TurraxIKA, Germany
TMB ELISA SubstrateAbcamab171523-1000ml
trypsin inhibitorDiamondA003570-0100
Tween-20Macklin, China9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometerHitachiU-3900

参考文献

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