膵島隔離のためのブタ膵臓の外科的灌流と隔離

要約

このプロトコルは、膵島の分離と精製のためのブタ膵臓の調達に関するステップバイステップのガイドを提供します。

要約

膵島移植は、I型糖尿病の新たな治療法です。ただし、ドナーのマッチングと利用可能性によって制限されます。ブタ島異種移植は、同種移植の有望な代替手段を提供し、オンデマンドで機能的な膵島の大規模生産の可能性を秘めています。単離された膵島の収量と生存率は、ドナー膵臓の品質と調達方法、特に温虚血時間の持続時間に非常に影響を受けやすいです。臓器の保存とその後の膵島の収量と生存率を改善するために、ブタ膵臓の外科的灌流と切除のためのプロトコルを開発しました。このプロトコルは、直接腎下大動脈カニューレ挿入と臓器灌流を採用して、温虚血時間を最小限に抑え、広範な外科的専門知識を持たないオペレーターの手順を簡素化します。その後、大動脈を介した膵臓の動脈灌流により、微小血管系から停滞した血液が洗い流され、それによって血栓症と組織への酸化的損傷が減少します。この原稿は、ブタ膵臓の外科的灌流と切除、続いて膵島の分離と精製のための詳細なプロトコルを提供します。

概要

1型糖尿病は、膵臓ベータ細胞の自己免疫破壊によって引き起こされます¹。その結果、患者は外因性インスリンに依存しており、高血糖および低血糖のエピソードを伴う高リスクの血糖変動に置かれます²。膵島同種移植は、I型糖尿病の潜在的な治療法です。ただし、膵臓臓器ドナーの利用可能性が限られていることは、この手順の広範な採用に対する主要な障壁であり続けています^2,3。ブタのドナーからの膵島の異種移植は、これらの動物が容易に入手できるため、有望な代替手段です。ブタ膵島分離の最適化とスケーリングは、進行する膵島異種移植にとって重要です。

いくつかのブタ膵臓調達技術が以前に発表されていますが、これらの手順の多くは、心臓死または放血の誘発後の膵臓切除術について説明しています4,5,6,7,8,9,10。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、ワシントン大学医学部比較医学部門の動物施設管理・使用委員会(IACUC)によって承認されています。この手順には、35〜35 kgの成体ヨークシャー豚が理想的です。ただし、このプロトコルは、実験の状況に応じてさまざまなサイズのブタに適合させることができます。手術室のセットアップでは、すべての手順を無菌的に実行する必要があります。

1.術前の準備と麻酔

1. 4 mg / kgのタイルタミンとゾラゼパム、20 mg / kgケタミン、および2 mg / kgのキシラジンを筋肉内注射したカクテルで豚を鎮静させます。.
2. 耳介静脈を介した末梢静脈アクセスを確立します。
3. 100%酸素中の1%-3%イソフルランを吸入して全身麻酔を誘発し、ブタに気管内挿管します。
   注:プロポフォールまたは別の静脈内導入剤と吸入剤を使用して、よりスムーズな導入および挿管手順のために導入することが好ましい場合があります。バイタルサイン、呼気終末 CO₂、酸素飽和度、および心波形を継続的に監視して、麻酔の深さを評価および維持します。腹部の手術面は、ベッドサイドの超音波を使用して確認されます。
4. 豚を剃り、胸骨のノッチから両側の鼠径部までグルコン酸クロルヘキシジンで準備します。
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ディスカッション

ブタドナーを使用した膵島異種移植は、I型糖尿病の治療のための有望な戦略です。膵島の分離は困難であり、最終的な膵島の生存率と収量は、臓器調達中に遭遇する低血圧および組織虚血に非常に敏感である^16,17。膵臓の調達と保存を最適化するために、このプロトコルは、大動脈カニューレ挿入、内臓分離、および膵島?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M NaOH, 100 mL	Millipore Sigma	1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 to 30 °C)	Thermo Fisher	14065056
1x D-PBS, 500 mL	Thermo Fisher	14200075
1x HBSS, 1 L	Thermo Fisher	14025076
250 mL Conical Tubes	Millipore Sigma	CLS430236-6EA
Amphotericin B [50 mg]	Millipore Sigma	PHR1662
Antiseptic Povidone Iodine 10%	Millipore Sigma	25655-41-8
BioRad Gradient Former	BioRad	395
Calcium Chloride dihydrate	Thermo Fisher	10035-04-8
COBE Cell Processor	Ebay	317690
Digestion circuit reservoir, Gibco bottle, 1 L	Thermo Fisher	10341001
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher	85190
Dithizone	Thermo Fisher	60-10-6
Gradient Former Connection Kit	BioRad	1652008
Heparin [1000 U/mL]	Emergency Medical Products	0409-2720-01
HEPES Buffer (1 M), 100 mL	Thermo Fisher	15630080
Human Serum Albumin 25%, 100 mL	Celprogen	HSA2001-25-1
Isoflurane	Covetrus	Item#:11695067772
Ketamine	Patterson	Item #:07-894-8462
Liberase (100 mg)	Millipore Sigma	5401020001
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher	L3224
Lympholyte 1.1 Media 500 mL	Cedarlane Labs	CL5020
Masterflex LS 16 Tubing	Masterfle	96419-16
Masterflex Peristaltic Pump	Masterflex	07522-30
PenStrep (2 mg/mL)	Celprogen	PS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/vial)	Dornase Alfa	8931278
Recovery Medium, PIM(R)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-R001GMP
RPMI 1640	Millipore Sigma	R8758-1L
Standard Culture Medium, PIM(S)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-S001GMP
Tzed™ (tiletamine and zolazepam) Injection C	Patterson	Item #:07-894-6240
University of Wisconsin (UW) Solution, 3 L	Global Transplant Solutions	1000-0046-06
Waterbath	Sigma Alderich	CLS6783-1EA
Xylazine	Patterson	Item #:07-891-6165