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要約

このプロトコルは、ユカタンのミニブタにおける再現可能な多深度熱傷創モデルについて説明しています。

要約

火傷の治癒は複雑で長いプロセスです。豊富な経験にもかかわらず、火傷センターの形成外科医と専門チームは依然として大きな課題に直面しています。これらの課題の中で、焼けた軟部組織の程度は初期段階で進化する可能性があり、保存的治療と壊死組織除去との間の微妙なバランスを生み出します。熱傷は最も一般的なタイプであり、火傷の深さは、温度や露光時間などの複数のパラメーターによって異なります。火傷の深さも時間とともに変化し、「シャドウゾーン」の二次的な悪化はよく理解されていない現象です。これらの課題に対応するために、いくつかの革新的な治療法が研究されており、さらに多くの治療法が初期開発段階にあります。現代の創傷被覆材や人工皮膚のナノ粒子は、これらの最新の治療法の例であり、まだ評価中です。これらを総合すると、熱傷の診断と熱傷治療の両方に大幅な進歩が必要であり、研究チームは新しいツールや治療法をテストするための信頼性と関連性のあるモデルを必要としています。動物モデルの中で、ブタは皮膚構造が人間と強く似ているため、最も関連性があります。具体的には、ユカタンのミニブタは、メラニンの色素沈着や成長の遅さなどの興味深い特徴を示し、高いフォトタイプと長期的な治癒を研究することができます。この記事は、ユカタンのミニブタの多深度熱傷を研究するための信頼性と再現性のあるプロトコルについて説明し、長期的なフォローアップを可能にし、診断および治療研究に関連するモデルを提供することを目的としています。

概要

火傷は主要な公衆衛生問題であり、National Burn Repository 1,2によると、米国では毎年480,000人以上の患者が罹患しています。これにより、綿密な治療を必要とする非致命的な複雑な症例で年間50,000人以上が入院しています2。さらに、火傷は軍隊の死亡率と罹患率の根本的な原因であり、軍隊の死傷者の10%から30%の原因となっています3,4。火傷の管理は、身体的から心理的、感情的なものに至るまで、患者に甚大で多様な影響を与えているにもかかわらず、長い間ほとんど変わっていません5。

熱傷の初期診断と評価は、熱傷の種類(第1、第2、および第3)または患部組織の深さ(表在性、部分的厚さ、および深い熱傷)によるベースライン分類につながります6,7,8。部分的な厚さの火傷 (第 1 度および第 2 度) は、表皮と真皮の異なる深さ (表在性または深部真皮、つまり表在性および深部の 2 度熱傷) に関与します9。特に、真皮深部の付属肢の損傷は、付属器上皮10からの再上皮化の可能性を排除します。定義上、全層熱傷は皮下脂肪、筋膜および/またはその下にある筋肉(第3度熱傷)、そして時には骨(第4度熱傷とも呼ばれる)に達する11,12。

入院後、火傷患者は、組織の創面切除と保存の微妙なバランスからなる戦略を含む特別なケアを受けます。損傷したおよび/または二次感染した軟部組織は、健康な組織が露出するまで徐々に除去する必要があり、治癒プロセスを改善するための特定の包帯および皮膚移植片の使用を可能にする13,14,15,16。それでも、手術中は、治癒組織の意図しない除去を避け、合併症を減らして最適な回復のために注意が必要です。生物学的には、火傷は「影」または「うっ血」ゾーンに囲まれた中央の壊死領域を示し、可逆的な虚血の可能性を示しています。この領域は、悪化して壊死ゾーンが拡大するか、またはアポトーシスプロセスを逆転させることによって治癒するかのどちらかである17,18。この火傷の重症度の違いは、外科医が正確に評価することが困難であり、保存的治療と外科的切除とのバランスを複雑にしています19。これまでのところ、バーンコンバージョンに先立つこの「シャドーゾーン」を特徴付けるのに役立つ効率的なツールは利用できません。このようなツールを開発することは、この微妙なバランスを最適化するために重要です。

二次熱傷の転換を減らすのに役立ついくつかの治療法がテストされています。しかし、現在、クリニックでは特定の治療法はありません18。火傷治療の進歩の他の例としては、最新の創傷被覆材とナノ材料の開発20,21、組織工学皮膚の開発22,23、および新しい表皮培養アプローチ24,25が含まれます。また、現代の再建手術と筋膜皮膚弁は、長期的な後遺症、特にひだ領域の病理学的治癒後の火傷拘縮の管理を改善しました26,27。これらの進歩は、火傷患者に有望な見通しを与え、彼らの治療戦略と生活の質を改善しますが、最近の結果は、機能的影響が物理的および心理的領域の両方で依然として大きいことを示しています28。これらを総合すると、熱傷診断と熱傷治療の両方における革新的な進歩に対する需要は相当なものです。

全体として、多くのアプローチは複雑な熱傷症例の診断、管理、および治療を改善することを目的としており、研究者はこれらの新しいアプローチをテストするために再現性のある関連モデルを必要としています。その生物学的な複雑さ、いくつかの臓器および全身反応が関与するため、熱傷創の過程を研究するために関連性が証明されたin vitroモデルはなかった29。げっ歯類モデルは、生物学、皮膚構造、弾力性、および基礎となる構造への順守の欠如における大きな違いにより、人間との大きな不一致を示している29。対照的に、ブタモデルは、ブタの皮膚とヒトの皮膚30,31,32の構造的類似性により、関連性があることが証明されている。それは、同様の血管新生、弾性線維組成、および更新タイミングを示します。さらに、毛包とアポクリン付属物は、臨床表在性火傷で観察できるように、島状再上皮化を可能にします33,34。より具体的には、ユカタンのミニブタモデルは興味深い特徴を提供し、色素沈着した皮膚35と最小限の身体的変化による長期的な結果36の研究に関連しています。

この記事の目的は、ユカタン豚の信頼性の高い多度熱傷モデルについて説明し、同じ主題でいくつかの第2度および第3度の熱傷の研究を可能にすることです。これにより、火傷の管理のための診断および治療の革新を研究するための関連性があり再現性のあるモデルが提供されます。さらに、このモデルは、さまざまな火傷の種類と重症度、火傷の拘縮と病理学的治癒の研究を可能にする長期追跡調査、および特定の特性を持つことが知られている色素沈着性皮膚の異なる行動を特徴としています。

プロトコル

すべての動物実験は、ARRIVE(Animal Research:Reporting In Vivo Experiments)チェックリスト37 に従って実施され、プロトコル #2021N000271 に基づくマサチューセッツ総合病院施設動物管理および使用委員会(IACUC)に準拠していました。動物には、実験動物の世話と使用に関するガイド38に従って、人道的なケアが提供されました。これらの実験には、30kgの雌のユカタンミニブタ5頭を使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1. 術前ケアと麻酔

  1. 全身麻酔の前に動物を12時間絶食します。
  2. 2〜4 mg / kgの塩酸チレタミンとゾラゼパム塩酸塩、および1〜2 mg / kgのキシラジンの筋肉内注射により麻酔を開始し、続いてイソフルラン(酸素中で2〜3%)を吸入します( 材料の表を参照)手順中に麻酔を維持します。.

2.火傷創の設計と無作為化

  1. 同じ動物でネガティブコントロールを使用した部分的および全層熱傷の両方を研究するために(個人間変動なし)、傍脊椎領域の各ブタの背側に8つの傷を作成します。全層創傷を 3 回、部分厚創を 3 回、コントロール創傷を 2 回行います。
  2. 傷に 1 から 8 までの番号を付け、ランダム化を実行して、背中のさまざまな解剖学的位置にさまざまな火傷度 (部分的な厚さ、完全な厚さ、コントロール) を割り当てます。
    注:各創傷(深さと位置)のランダム化は、重要性を改善するために行われます:ブタの真皮は、厚さとコラーゲン組成39の点で異なることが知られています。したがって、各動物のランダム化は、潜在的なバイアスを減らすために使用されます。

3.タトゥーの傷の区切り

注:最初の手順は、ランダム化された傷の位置を特定し、番号を付けるために、豚の背部に円形の入れ墨を作成することで構成されます(図1)。これは、順応性を高めるために最初の火傷手順の2日前に実行されますが、火傷手順の日に実行できます。

  1. 麻酔(ステップ1参照)および仰臥位での口腔気管挿管40の後、ブタを腹臥位に置き、動物の快適性と安定化のために柔らかいくさび(ベッドシーツ)を動物の下(前肢、臍帯、および後肢の下)に置く41。適切な体温を維持するために、動物の頭と首に強制空気加温ブランケットを置きます。
  2. ブタの背中の中央に直線を配置して、図面の対称性を確保します。
  3. 中心線の両側にダーモグラフィックペン( 資料表を参照)を使用して、中心線から横方向に6.5cm配置された2本の垂直線を引きます。2 本の横線を使用して、円の中心を配置します。
  4. 直径4.5 cmの円の各ペアを対称的に描き、2つの異なる円の間に4 cm以上の距離を保ちます(図1A)。
  5. 描画が完了したら、シングルステップの皮膚調製(ポビドンヨード7.5%)を実行して、皮膚細菌叢を減らします。
  6. ニードルタトゥーマシン、滅菌黒インク、滅菌した5点針を使用して、8つの4.5cm円のうち42 のタトゥー手順を実行します( 材料の表を参照)。最終結果を 図 1B に示します。
  7. 火傷の発生が遅れた場合は、タトゥーにトリプル抗生物質軟膏を塗布し、透明な粘着性包帯で覆います。

4.火傷創創の作成と高度な創傷被覆材

注:火傷は、真鍮ブロックを専用スポット(ランダム化)の皮膚に接触させて30秒(不変)配置することにより作成されます。温度によって燃焼深度が決まります。

  1. 火傷処置の日に、動物が麻酔され、ステップ1で説明したように腹臥位に置かれたら、アルミニウムビーズで満たされたステンレス鋼容器に円筒形の真鍮ブロックを置きます( 材料の表を参照)。容器を温度制御されたホットプレートに置きます。1つのホットプレートを65°C(部分的な厚さの燃焼用)に設定し、2番目のホットプレートを93°C(全層の燃焼用、 図2)に設定します。
    注:火傷を避けるために容器を乾いた状態に保つことができます(温度平衡に達するには2〜3時間必要)または水で半分満たされます(温度平衡に達するには30分)。水を使用する場合は、火傷によるその後の火傷を避けるために、ステップ4.5の前に真鍮ブロックを完全に乾燥させる必要があります。
  2. 真鍮製のシリンダーの中央の開口部 から 温度計を挿入してコア温度を監視し、温度ガンで表面温度を確認します。必要に応じて、わずかな熱放散にもかかわらず、シリンダー内のホットプレートの温度を65°Cまたは93°Cに上げます。
    注:アルミホイルを使用して容器を覆い、熱放散をさらに最小限に抑え、希望の温度により早く到達できます。
  3. 並行して、入れ墨の手順(ステップ3.1)と同様に、動物を火傷の手順のために腹臥位に置きます。
  4. 動物が腹臥位の準備ができたら、3つのステップ(ポビドンヨード7.5%、生理食塩水0.9%、乾燥)で皮膚を準備します。
  5. 真鍮のブロックを耐熱手袋でつかみ、ランダム化に応じて専用のタトゥースポットに置きます。真鍮のブロックが肌に触れたらすぐにタイマーを開始します。真鍮ブロックの自重以上の圧力が皮膚に加わらないように注意してください。
  6. 30秒後、真鍮ブロックを皮膚から取り外し、専用の加熱容器に戻します。目標に達するまで温度を監視し、すべての傷に対して手順を繰り返します。
  7. 動物が回復した後のドレッシングの安定性を確保するために、高度な多層ドレッシングを実行します。
    1. コントロールを含む各燃焼場所に石油含浸ガーゼを置き、乾燥した不織布ガーゼと大きな透明な接着剤ドレッシングで覆います。
    2. ベンゾイン溶液のチンキ剤を周囲の皮膚にスプレーして、透明なドレッシングが皮膚に密着します。
    3. 動物を自己接着性の粘着ラップドレッシングで包み、締めすぎないように注意します(肺容量の制限)。
    4. チューブラーストッキネット(動物に適したサイズ)の最終層を追加してドレッシングを完成させます( 材料の表を参照)。あるいは、動物が研究期間中にドレッシングを清潔に保つことができない場合は、カスタムフィットの豚ジャケットを使用することもできます
    5. ブプレノルフィンの単回投与(0.05-0.1 mg / kg、IM)とカルプロフェンの単回投与(2-4 mg / kg、IM)を注射した後、動物の首に経皮オピオイド(フェンタニル)パッチを貼ることにより、正しい鎮痛を確保します。
    6. 各麻酔薬の後、回復後2時間まで動物を注意深く監視します。.必要に応じて温かいパッドを使用し、完全に立った状態になったら自由に食事を提供します。

5.全層熱傷痂開術

注: 術後 1 日から 3 日の間に、動物は 3 度の火傷の後、痂皮の全層外科的切除を受けます。

  1. 麻酔、挿管、および動物を仰臥位に置くことを含む動物の同様の調製後、3段階の皮膚調製により皮膚を調製し、動物の背中の滅菌ドレープを行う。
  2. 傷口に4mmパンチ生検( 材料の表を参照)を行い、損傷の種類を確認します。
  3. 痂皮切開術43,44は、滅菌メス刃(n°15)で痂皮を円形に切開し、真皮深部に到達するまで行います。
  4. 痂皮の片側を滅菌済みのAdson組織鉗子(2/1歯付き)( 材料の表を参照)でしっかりとつかみ、上向きにヒッチして痂皮の深い限界を明らかにします。
  5. 深部真皮/下にある筋膜内の同じ平面に留まりながら、メスの刃を使用して痂腔切開術を続けます。真皮の出血は、組織の生存能力の兆候と考えられています。
    1. プロセス中に細動脈を切断する場合は、バイポーラ凝固鉗子を使用して最小限の焼灼を行います( 材料の表を参照)。注意:作成された創傷床の広範な焼灼は、治癒の遅延につながる可能性があるため、厳密に避ける必要があります。
  6. 最初の乾燥グアゼを創傷床に5分間置いて、局所止血を促進してから、決定的なドレッシングを装着します。
  7. 以前と同様に傷口を包帯し(ステップ4.7)、空洞を埋めるためにいくつかの乾燥ガーゼを追加します。チンキ剤ベンゾインスプレー、粘着性透明ドレッシング、粘着性ラップ、管状ストッキネットなど、前述のものと同じ層を適用します。
  8. オピオイド経皮パッチを変更し、カプロフェン(2-4 mg / kg、IM)を注射することにより、鎮痛を提供します。.

6. フォローアップ創傷被覆材

注:その後の包帯は、実験的な治療デザインと動物の耐性に応じて、2〜7日ごとに行われます。創傷被覆材は、乾燥した環境での再上皮化を可能にし、動物の耐性を改善するために、21日後に停止することができます。あるいは、治療群が湿った環境または湿った環境を必要とする場合、ドレッシングは研究が終了するまで延長することができます。追跡期間は、急性治癒過程と長期治癒過程の両方を研究するために、最大10週間延長されました。

  1. 動物に短時間麻酔をかけ、ノーズコーン(イソフルラン2-5 L / min)で仰臥位に置きます。
  2. 以前の包帯を取り外し、滅菌0.9%生理食塩水と滅菌ガーゼを使用して創傷を洗浄します。
  3. 該当する場合は、実験的治療を適用します。
  4. 同様に、研究で必要に応じて、この手順中に後続の生検を行います。その後、動物はカルプロフェン(2-4 mg / kg、IM、24時間効果)などの鎮痛剤を投与する必要があります。
  5. 対照創を含むすべての創傷部位を、石油含浸または同等のガーゼ、乾燥ガーゼ、不織布ガーゼ、および接着剤の透明なドレッシングで覆います。.

結果

図2A、B は、ユカタンのミニブタの背部に複数回の火傷を負わせた結果を示しています。創傷(I)および(VII)は対照創傷(37°C)である。第2度創傷(II;IIIおよびVIII)は、激しい発赤と水疱を伴います。対照的に、第3度創傷(IV;V;およびVI)は青白く、触診に誘起されます。創傷VIIIは第2度と第3度の中間に見えることに注意してください:進行中の...

ディスカッション

火傷後の創傷治癒は、最大で数か月かかる可能性のある長いプロセスであり、さまざまな治療オプションと患者のケアに関する考慮事項があります2,13。それを研究するためには、信頼性と再現性のあるモデルが必要です。主にげっ歯類29,45,46とブタ

開示事項

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、Shriners Children's Research GrantからS.N.T. Y.B.への寛大な資金提供によって支援されました。また、米国国立衛生研究所(K99/R00 HL1431149;R01HL157803;R01DK134590、R24OD034189)、アメリカ心臓協会(18CDA34110049)、ハーバード大学医学部エレノアおよびマイルズショアフェローシップ、ポルスキー家族財団、およびMGH外科および/またはMGH研究執行委員会を代表してクラフリン特別奨学生賞。さらに、マサチューセッツ総合病院研究実行委員会がR.J.にFund for Medical Discovery(FMD)賞を授与するために提供した支援に感謝します。最後に、Fondation des Gueules Cassées(フランス)、レンヌ大学(フランス)、CHU de Rennes(フランス)、フランス形成外科学会からのY.B.への支援が高く評価されています。著者らは、Knight Surgery Research Laboratoryの貢献と動物の麻酔の支援に感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Adson tissue forcepsJarit130-234
Aluminum beadsLab Armor42370-002Lab Armor Beads 
Buprenorphine hydrochlorideRanbaxy PharmaceuticalsNDC:12469-0757-01Buprenex Injectable
CarprofenPfizerNADA 141-199Rymadyl 50mg/ml injectable 
Cylindric brass blockHand-madeN/AEngineering drawing included in the manuscript
Dermographic penMcKessonSurgical Skin Marker Sterile
Disposable #15 surgical scalpelsMedlineMDS15315Scalpel blades
Fentanyl patchMylanNDC:60505-7082Fentanyl Transdermal System
Isoflurane PiramalNDC:66794-013-25Isoflurane, USP
McPherson Bipolar coagulation forcepsBovieA842Reusable, autoclavable
Miltex assorted biopsy punches (3,4 and 5 mm)Integra33-38Biopsy punches- size to adapt to the study
Non woven gauzeStarryshineGZNW222 x 2" non woven 4 ply medical gauze pads
Povidone-IodineBetadineNDC:0034-9200-88Surgical scrub 7.5% 
Sterile isotonic sodium chloride solution 0.9%Aqualite SystemRL-2095Sterile saline solution
Tattoo inkSpaulding & RogersBlack - 2 oz - #9053
Tattoo markerSpaulding & RogersSpecial Electric Tattoo Marker
Tattoo needleSpaulding & Rogers1310251Tattoo 5 point needle
Tegaderm Transparent Film Dressing3M1.628Large transparent adhesive dressing
Temperature-controlled hot plateCole-Parmer03407-11StableTemp hot plate stirrer
ThermometerAmerican ScientificU14295Tube mercury thermometerr
Tiletamine and zolazepam hydrochlorideZoetisNDC:54771-9050Telazol
Tincture of Benzoin SpraySmith&Nephew407000Adhesive layer spray
Triple Antibiotic ointmentFougeraNDC 0168-0012-31Triple antibiotic ointment
Tubular stockinetteMedlineNONNET02Curad Medline Latex Free Elastic Nets
Warming blanket3MBair Hugger 750 warming unit
Xeroform Occlusive Gauze StripCovidien8884433301Xeroform petrolatum wound dressings
XylazineVetoneNDC:13985-704-10AnaSed LA
Yucatàn minipigs (female, 30 kg)Sinclair Bio ResourcesN/AFull pigmentation 

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