MLH1 の大腸がん患者における末梢血中の遺伝子発現と大腸がんとの関連

要約

この研究では、末梢血と結腸がんにおける MLH1 遺伝子発現との関連を調べ、ケースコントロールアプローチを利用して患者と対応する健康なコントロールの発現レベルを比較します。

要約

MutLホモログ1(MLH1)は、ヘテロ二量体複合体MutLαの成分であり、塩基間ミスマッチやヌクレオチドの誤取り込みによる挿入/欠失ループを検出・修正します。MLH1タンパク質が存在しないと、修復されていないミスマッチの頻度が増加し、臓器がんを引き起こします。現在の研究では、結腸直腸癌(CRC)患者の血液サンプルにおけるMLH1遺伝子発現と、 MLH1 遺伝子発現と腫瘍浸潤(T)およびリンパ節浸潤(N)との関係を定量化することを目指しました。血液サンプルは36人の大腸がん患者から採取した。RNAを抽出し、キットを用いてcDNAを合成しました。プライマーはエクソン-エクソンジャンクションアプローチを使用して構築され、 MLH1 および β-アクチン 遺伝子は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムPCR)を使用して3回テストされました。遺伝子発現解析ソフトウェアを使用してデータを解析し、t検定を使用して MLH1 の発現とT変数およびN変数との関連を調べました。この研究では、平均年齢が57.35歳±4.22歳、年齢が26〜87歳の女性15人(41.6%)と男性21人(58.4%)を含む36人の結腸直腸癌患者が含まれていました。その結果、 MLH1 遺伝子発現率は健常者に比べて減少し、疾患の各病期における遺伝子発現の減少は有意であることが示されました。この研究の結果は、 MLH1 遺伝子発現の減少がCRCの発症に有効な役割を果たすことを示しました。

概要

結腸がん(CRC)は、最も一般的な種類のがんの1つです。これは、世界中で4番目に多いがん関連死の原因です¹。CRCは女性よりも男性に多く見られ、先進国では発展途上国よりも3〜4倍一般的です。大腸がん発生率の1×10⁵当たりの年齢標準化(グローバル)発生率は、男女ともに19.7人、男性で23.6人、女性で16.3人^{である2。}疫学研究では、CRCと環境および生活習慣との強い関連性が示されています。肥満、赤身肉/加工肉、タバコ、アルコール、アンドロゲン除去療法、および胆嚢摘出術はすべて、CRCリスクの適度な増加と関連しています^2,3。

染色体不安定性、マイクロサテライト不安定性、およびCpGアイランドメチル化表現型(CIMP)は、CRC⁴の腫瘍形成に重要な役割を果たします。これまでの研究によると、CRC患者では約250の異なる変異が同定されており、これはDNAミスマッチ修復(MMR)遺伝子に関連する既知の変異の約55%に相当します。ミスマッチ修復タンパク質の欠損は、MSH6、MLH1、PMS2、およびMSH2遺伝子の生殖細胞変異によって引き起こされる可能性があり、これらの変異のほとんどはMLH1およびMSH2遺伝子に見られます^4,5。MMR系で最も重要なタンパク質は、通常はCRCに関与しており、MLH1です。最近の研究では、MLH1の発現に何らかの変化があると、CRCのリスクが増加する可能性があることが示されています。MLH1の生殖細胞変異は、遺伝性のCRCであるリンチ症候群の原因です。さらに、びまん性結腸がん症例の13%〜15%は、体細胞プロモーターの過剰メチル化に基づくMLH1欠損症によって引き起こされます^6,7,8。

MLH1遺伝子は、3番染色体の短腕の22.2位に位置し、21個のエクソン⁹を含んでいます。MLH1遺伝子にコードされたタンパク質は、ミスマッチ修復に関与するエンドヌクレアーゼPMS2と協調して、MMRシステムの一部であるMutLαを生成することができます。MutLαは、主に塩基間ミスマッチの修復や、不完全なDNA複製による欠失・付加ループの修復に関与しています。さらに、コードされたタンパク質はDNA損傷シグナル伝達に関与しており、減数分裂10,11,12で観察されるDNAミスマッチ修復に関与するMLH3タンパク質とともにɣMutL型に変換することができます。研究によると、MLH1は、細胞周期チェックポイントの調節、アポトーシス、クロスオーバー組換え、および有糸分裂の不適合性など、他の主要な細胞活動に関与していることが示されています¹³。

MLH1遺伝子は、DNAミスマッチ修復(MMR)システムにおいて重要な役割を果たしています。この遺伝子の機能に欠陥があると、遺伝子変異が蓄積し、その結果、結腸直腸癌が発症する可能性があります¹⁴。これまでの研究では、大腸がん患者のMMR遺伝子に関連する変異の約55%がMLH1遺伝子変異に関連していることが示されています。さらに、MLH1遺伝子発現の低下は、結腸直腸癌の遺伝型であるリンチ症候群につながる可能性があります^15,16。また、体細胞プロモーターの過剰メチル化に基づくMLH1遺伝子の欠損は、散発性結腸直腸癌症例の13%〜15%で観察されています¹⁷。これらの科学的証拠は、MLH1遺伝子が結腸直腸癌の重要なバイオマーカーとして作用することを示しており、その発現分析はMMR経路の機能と^CRC18の遺伝的リスクに関する貴重な情報を提供できることを示しています。結腸がん患者の末梢血中のMLH1発現レベルを測定することで、結腸がんでしばしば破壊されるMMR経路の機能に関する貴重な情報を得ることができます。この方法は、予後目的や結腸癌に対する遺伝的感受性を理解するために使用できます^19,20。中国人患者におけるMLH1 415遺伝子座GからCへの変異と散発性結腸直腸癌との関係に関する研究では、MLH1 C/C遺伝子型の頻度は対照よりも散発性CRC患者で有意に高かったことがわかった。これは、中国人患者における散発性CRCに対する遺伝的感受性を示唆している²¹。別の研究では、炎症性腸疾患(IBD)患者の末梢血および生検サンプルにおけるCRC遺伝子バイオマーカーの遺伝子発現を比較し、結腸癌関連バイオマーカーを理解するための末梢血遺伝子発現分析の可能性を強調しています²²。

MLH1遺伝子の重要な役割と、ここ数十年にmRNA発現をプロファイリングして分子解析を行った研究を考慮すると、がんはより高精度に分類されています。本研究の目的は、大腸がん患者の末梢血検体におけるMLH1の発現をリアルタイムPCRを用いて定量的に調べ、病理因子との関連、腸壁層への腫瘍進行段階(T)、リンパ節への浸潤段階(N)を調べることでした。この研究は、末梢血サンプルを使用した CRC スクリーニング、予後、および診断のためのバイオマーカーとして遺伝子発現の量的変化を確立する可能性を秘めて、36 人の CRC 患者で実施されました。

プロトコル

2021年4月から2023年5月にかけて、南通大学附属病院2で症例対照研究が実施されました。病院の管理部門と協力して、研究の枠組みを確立します。倫理的承認は、研究提案書を南通大学倫理委員会に提出することにより得られました。機密性とインフォームドコンセントを確保するために、倫理ガイドラインが守られました。

1. 患者様のリクルートと研究デザイン

1. 研究に参加者を含めるためのサンプリング
   1. 結腸がん患者36名と対照群の末梢血中の MLH1 遺伝子の発現を調査します。参加者の選択のための明確な包含基準と除外基準を作成します。
   2. 特定の種類の結腸がん(直腸S状結腸がん、盲腸がん、上行結腸がん、横断がん、および下行結腸がんで、結腸直腸腫瘍があると見なされた)と診断され、インフォームドコンセントがある個人を募集します。
   3. 他のがんの診断や、遺伝子発現解析を混乱させる可能性のある疾患を持つ個人は除外します。さらに、過去 3 か月間の輸血歴、過去 6 か月間の化学療法または放射線療法の病歴、アルコールまたは薬物使用の病歴、および自己免疫疾患または炎症性腸疾患の病歴のある参加者を除外します。
2. TNM(Tumor, Nodes, and Metastasis)病期分類システムに従って、がんの質量、腫瘍の大きさ、および隣接臓器への浸潤を考慮して、臨床危険因子を分類する^23,24。
   1. 利用可能な病理ファイルデータに基づいて、さまざまながんの病期(0〜4)を分割します。
   2. 腸壁層の腫瘍の成長と進行の速度 (T インデックス) を 4 つの異なるグループ (T1-4、T0-TX) に分割し、リンパ節浸潤 (N インデックス) を 4 つのグループ (N1-3、N0-NX) に分割します。
3. 健康な個人と対照群を準備します。
   1. 年齢と性別に関して、対照群を患者群と一致させます。各参加者の詳細な人口統計データを収集して、比較可能性を確保します。
4. インフォームドコンセントのプロセス
   1. 研究の目的、手順、および潜在的なリスクを説明するインフォームドコンセント文書を準備します。
   2. 参加者と交流し、質問をするための十分な時間を提供します。サンプル収集を進める前に、署名入りのインフォームドコンセントフォームを収集してください。

2. RNAの抽出と精製

1. 末梢血サンプルの収集
   1. 臨床または実験室での使用が認定された市販のEDTAコーティングチューブを入手してください。チューブの有効期限を確認します。チューブのパッケージの完全性を確認してください。
   2. 参加者に楽に座るように指示します。滅菌注射器を使用して、肘前静脈から5mLの血液を採取します。参加者がリラックスし、腕を伸ばして静脈を露出させていることを確認します。血液サンプルを準備済みのチューブにすぐに移し、空気への曝露を最小限に抑えます。
   3. ラボへの輸送中は、RNAの完全性を維持するために、サンプルを4°Cに維持してください。
2. RNA単離には、メーカーの指示に従ってRNA血液ミニキットを使用してください。
   1. 簡単に説明すると、全血サンプルをBuffer ELと氷上でインキュベートすることにより、赤血球を溶解します。遠心分離機で白血球をペレット化し、上清を捨てます。白血球をBuffer RLTで溶解し、シュレッダーカラムを使用してライセートをホモジナイズします。
   2. 均質化したライセートにエタノールを添加し、スピンカラムに移します。カラムをBuffer RW1およびBuffer RPEで洗浄します。精製したRNAを溶出するには、RNaseフリーの水をカラムに加え、遠心分離します。
3. RNAの量と品質の評価
   1. RNAの定量:分光光度計を使用してRNAの濃度と純度を測定します。接続されたコンピューターでソフトウェアを開きます。メインメニューから「Nucleic Acid」オプションを選択します。1 μLのRNAサンプルをサンプル領域に塗布します。
   2. RNAの純度と完全性を試験
      注:RNA血液ミニキットで精製した全RNAの完全性とサイズ分布は、分光光度計とゲル電気泳動で確認することができます。リボソームRNAは、鋭いバンドまたはピークとして現れるはずです。28S rRNAと18S rRNAの見かけの比率は、約2:1であるべきです。特定のサンプルのリボソームバンドまたはピークが鋭くなく、より小さなサイズのRNAに対する塗抹標本として現れる場合。サンプルは、RNA精製前または精製中に大きな分解を受けた可能性があります。
      1. 分光光度測定の場合は、デバイスのアームを下げて [測定] をクリックし、A260 / A280比を取得します。A260/A280比が1.8から2.0になることを目指して、RNAサンプルの純度を評価します。
      2. 以下に説明するように1%アガロースゲル電気泳動を行います。
         1. 1%アガロース溶液をTAEバッファーで溶解するまで加熱することにより、調製します。アガロース溶液に臭化エチジウムを添加して、最終濃度0.5 μg/mLにします。アガロース - エチジウムブロマイド溶液をゲルキャスティングトレイに注ぎ、固化させます。
            注:臭化エチジウムは、RNAとインターカレートしてUV光下での可視化を可能にする蛍光色素です。
         2. RNAサンプルをローディング色素と混合し、固化したゲルのウェルに慎重にロードします。ゲル電気泳動を100 Vで約30分間実行し、RNAフラグメントをサイズごとに分離します。ゲルをUVトランスイルミネーターまたはイメージングシステム上に置くと、エチジウムブロマイド染色されたRNAが蛍光を発します。
4. 抽出されたRNAの保存
   1. 抽出したRNAサンプルを採取します。RNAを滅菌微量遠心チューブに分注し、1分あたり10 μLの容量を使用します。RNAアリコートは-80°C以下で保存してください。
5. RNAのcDNAへの逆転写
   1. 逆転写キットのプロトコルに従ってください。必要な試薬を氷上および室温で解凍し、調製します。
   2. ゲノムDNA除去反応を行い、ゲノムDNAコンタミネーションを除去します。
   3. テンプレートRNAを除くすべての成分を含む逆転写マスターミックスを氷上で調製します。
   4. DNA除去ステップのテンプレートRNAを逆転写マスターミックスに添加します。逆転写反応を42°Cで15分間インキュベートします。
   5. 逆転写酵素を不活性化するには、95°Cで3分間インキュベートします。完成したcDNAのアリコートを使用してすぐにリアルタイムPCRを行うか、cDNAを-20°Cで保存して後で使用します。

3. リアルタイムPCRのためのプライマー設計

1. 標的遺伝子と内部制御の選択
   1. MLH1遺伝子は、結腸がんとの関連があるため、定量のターゲットとして選択します。遺伝子発現データの標準化のための内部コントロールとしてβ-actinを選択します。
2. プライマー設計プロセス
   1. プライマーデザインソフトウェアを起動し、EnsembleまたはUCSC Genome Browserから取得した MLH1 の遺伝子配列を入力します。
   2. プライマーの融解温度(Tm)を58〜60°C、最適なGC含有量を40%〜60%、プライマーの長さを18〜24ヌクレオチドに設定します。
   3. 設計したプライマー配列をNCBI BLASTデータベースに入力し、特異性を確認します。
      1. BLAST の Web サイトにアクセスし、[ Nucleotide BLAST] を選択します。プライマー配列を検索ボックスに貼り付けて、 BLASTをクリックします。
      2. 結果を分析して、オフターゲット増幅が予測されないことを確認します。詳細については、 表 1 を参照してください。

4. リアルタイムPCR

1. リアルタイムPCR反応のセットアップ。詳細については、 表 2 を参照してください。
   1. 試薬を4°Cで5分間、10,000 x g で遠心分離し、チューブの底に内容物を回収します。
   2. 市販のキットプロトコル(SYBR Green、バッファー、dNTP、MgCl₂、Taqポリメラーゼを含む)に従ってマスターミックスを調製します。
   3. マスターミックスを標識PCRチューブに割り振ることで、サンプル間の容量の一貫性を確保します。
   4. MLH1およびβ-actin用の適切な量のフォワードプライマーとリバースプライマーをそれぞれのチューブに添加します。
   5. 逆転写前にRNAサンプルを一貫した濃度の100 ng/μLに希釈し、逆転写キットを使用してcDNAに逆転写します。
2. 増幅とデータ収集
   1. PCRチューブをリアルタイムPCRシステムに挿入します。
   2. サーマルサイクラーは、変性に95°Cで20秒、アニーリングに54°Cで30秒、伸長に72°Cで30秒という最適化されたサイクル条件でプログラムします。詳細については、 表 3 を参照してください。
   3. マシンを45サイクル実行するように設定します。
   4. システムのソフトウェアインターフェースで反応をリアルタイムで監視し、各サンプルの増幅曲線を観察します。
   5. 汚染をチェックするために、cDNAを含まないネガティブコントロールを含めます。データの信頼性を確保するために、各サンプルに対してPCRランを3回繰り返します。
3. データ分析
   1. サイクルが完了したら、システムのソフトウェアを使用してしきい値サイクル(Ct)値を分析します。Ct値をスプレッドシートプログラムにエクスポートして、さらに分析します。
   2. ^2-ΔΔCt法²⁵を用いて相対的な遺伝子発現を計算し、データをβ-アクチンコントロールに正規化する。

5. 免疫組織化学・遺伝子解析

1. 組織切片で免疫組織化学を行い、MLH1タンパク質の発現を遺伝子発現レベルと相関させます。
   1. 組織スライドを調製し、抗MLH1抗体を塗布します。
   2. HRP標識二次抗体およびDAB(3,3'-ジアミノベンジジン)基質キットを使用してください。キットの指示に従ってスライドを作成し、光学顕微鏡で分析します。
2. メチル化特異的PCRおよびマイクロサテライト不安定性試験を実施して、リンチ症候群と散発性CRCを鑑別します。
   1. 市販のDNA抽出キットを使用してください。血液組織と腫瘍組織の両方について、キットのプロトコルに従ってください。
   2. バイサルファイト変換キットでDNAを治療します。MLH1プロモーター領域用に設計されたメチル化特異的プライマーを使用してください。キットのプロトコルに従ってPCRを実行します。
   3. PCR産物に対してゲル電気泳動を行い、メチル化状態を可視化します。
   4. マイクロサテライト不安定性試験(MSI)では、遺伝子分析装置を用いたキャピラリー電気泳動を行います。蛍光標識されたPCR産物を分析することにより、マイクロサテライトの長さを比較します。

6. 統計分析

1. データ分析には商用統計分析ソフトウェアを使用します。
   1. ソフトウェアを開き、遺伝子発現と人口統計データの新しいデータセットを作成します。
   2. 相対的な遺伝子発現値と対応する人口統計データをデータセットに入力します。
   3. Kolmogorov-Smirnov検定を使用して、データの正規性を評価します。
      1. トップメニューから 「分析 」を選択し、「 ノンパラメトリック検定」を選択し、「 レガシーダイアログ」を選択します。
      2. Kolmogorov-Smirnov Testをクリックし、遺伝子発現の変数を入力します。テストを実行し、分布正規性の有意性について出力を解釈します。
   4. T検定を実施して、患者群と対照群の間で MLH1 遺伝子発現を比較します。
      1. 「分析」→「平均の比較」を選択し、「独立サンプルのT検定」を選択します。
      2. グループメンバーシップ(患者またはコントロール)をグループ化変数として割り当て、遺伝子発現をテスト変数として割り当てます。検定を実行し、両側の有意水準を解釈します。
   5. ^2-ΔΔCt法²⁵を用いて遺伝子発現の倍率変化を計算する。

結果

この研究では、結腸がんの36人の患者が、末梢血中の MLH1 遺伝子発現と結腸がんとの関係について調べられました。人口統計学的変数の分析により、15人の患者(41.6%)が女性であり、21人の患者(58.4%)が男性であることが示されました。患者の平均年齢は57.35歳±4.22歳で、年齢層は26〜87歳でした。患者のボディマス指数(BMI)の状態は、14人の患者(38.8%)が正常なBMI(18.5...

ディスカッション

本研究は、 MLH1 遺伝子の発現を調べることを目的として行われました。この研究では、健康な人に比べて病気の人では MLH1 遺伝子の発現レベルが減少することが示されました。倍率変化の研究に基づいて、健康な人と比較して、病気の人のステージII、ステージIII、およびステージIVでの MLH1 遺伝子の発現は有意に減少したことが示されています?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Gel Electrophoresis Equipment	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT Systems	Used to check RNA quality
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884	Used as an anticoagulant for blood samples
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to determine RNA purity
Real-time PCR Machine	Applied Biosystems	A34322	Used for RT-PCR reactions
RNA Extraction Kit	Intron Biotechnology Co	#Cat 17061	Used for RNA extraction from blood samples
SYBR Green PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	4309155	Reagents used for RT-PCR experiments